双向电泳

1. 原理

双向电泳（two-dimensional electrophoresis）又称2D电泳，是蛋白质组学研究的重要手段之一，是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

双向电泳操作流程主要为样品处理（蛋白提取）→等电聚焦→SDS-PAGE电泳→染色→扫描→图像分析。

2. 样品处理

    样品制备是双向电泳中*为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的*大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在*终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

    目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：

（1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提*大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；

（2）减少对蛋白质的人为修饰；

（3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。 

培养细胞样品处理方法：

收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞几次，常规离心收集细胞沉淀。然后加入裂解缓冲液（Lysis buffer），使细胞充分溶解。离心收集上清即为细胞总蛋白，取部分用作蛋白定量，余下分装到Ep里-80°C保存。裂解缓冲液配方有多种，主要成份有尿素（离液剂）、离子去垢剂（CHAPS）、还原剂（DTT）和Tris-Base。 

组织样品处理方法：

    取大小适中的组织块，用去离子水洗净组织表面。用研钵在液氮冷冻条件下将组织块研成粉末，加入适量的裂解液，使组织内的细胞裂解。组织悬液4°C、12000 rpm离心10 min收集上清。然后再高速离心收集上清，取部分上清用作蛋白定量，余下分装到Ep里-80°C保存。

3. **向等电聚焦

（1）取适量水化上样缓冲液和样品蛋白，充分混匀；

（2）从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟；

（3）沿着水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品。在槽两端各1 cm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布；

（4）当所有的蛋白质样品都已经加入到水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层；

（5）分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上，确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外；

（6）在每根胶条上覆盖2－3 ml矿物油，防止胶条水化过程中液体蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上；

（7）对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序；

（8）聚焦结束的胶条，立即进行平衡、**向SDS-PAGE电泳，或将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

4. **向SDS-PAGE电泳

（1）配制10%或12%的丙烯酰胺凝胶，待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗；

（2）从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解；

（3）配制胶条平衡缓冲液I。

（4）在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹；

（5）将胶条转移至样品水化盘中，加入适量胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟；

（6）配制胶条平衡缓冲液Ⅱ；

（7）**次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟；

（8）用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的**向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己；

（9）将琼脂糖封胶液进行加热溶解；

（10）将10×电泳缓冲液稀释10倍，成1×电泳缓冲液，赶去缓冲液表面的气泡；

（11）**次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）；

（12）将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作；

（13）将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液；

（14）用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面；

（15）放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固；

（16）打开二向电泳制冷仪，调温度为 15℃；

（17）待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流。待样品完全走出IPG胶条浓缩成一条线后，再加大电流，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

（18）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

5. 染色

进行银染或考马斯亮蓝染色，并适当脱色。

6. 图像采集和斑点分析

7. 双向电泳技术的局限性及方法的改进

    虽然双向电泳技术具有其他蛋白质分离技术无可比拟的分离能力，目前仍然存在着一些技术细节上的挑战和缺陷。主要有以下几个方面:

（1）蛋白样品制备效率偏低

样品制备是双向电泳的**步，其成功与否是决定双向电泳分离能力高低的关键。在蛋白质样品提取过程中，一些低浓度蛋白质往往会相对过早丢失。此外，一些难溶的蛋白，尤其是膜蛋白的提取效率较低。目前一些公司如Bio-Rad研制出一种顺序提取试剂盒，专用于提取一些难溶的膜蛋白。

（2）疏水性膜蛋白的难于分离与检测

一般来说，疏水性膜蛋白比亲水性蛋白质更难操作。膜蛋白更易于聚集在管壁上，由于蛋白质组的研究常在nmol甚至fmol水平上进行，这种特性将会导致很大的损失，甚至完全丢失。另外，α-螺旋跨膜蛋白在变性的2-D胶上不能很好被有效分离。若要分离这些蛋白质，需要有机溶剂分馏法或者反相HPLC等技术的辅助。

（3）极端酸性或碱性蛋白质的难于分离

极性蛋白质尤其是碱性蛋白质在细胞中常与DNA结合，在信号转导中起着调控作用，因此分离这类蛋白质有着很重要的意义。在胶条水合时,选用窄范围IPGs（固相PH梯度胶条）如pH 3~7或pH 7~10水合上样会引起明显的横纹,影响蛋白点的分离。目前用杯上样水合可以提高分离效果。在杯上样时，一般将蛋白样品放在酸性窄范围IPGs的阴极端或在碱性窄范围IPGs的阳极端。

（4）蛋白质的动态分辨率有待提高

对于一根固定长度和pH范围的IPGs胶条，*多能分离几千个蛋白质。因此，要将某一种组织的所有蛋白质在仅一个pH范围的IPGs上分离是不可能的。一般采用多个pH范围的IPGs进行分离。在样品水合上样前,需将蛋白样品按不同pH范围进行预分离，可以提高低丰度蛋白质的分辨率。

（5）自动化程度需进一步提高

在双向电泳进行过程中，有不少步骤需要手工操作，因此比较费时，而且易产生误差，造成低重复性。也不利于实现高通量分离蛋白质。目前，双向电泳后半部分操作如蛋白胶图的软件分析和蛋白点的切割和处理已实现半自动化，大大加速双向电泳进程。蛋白质组学理想的高通量全系统方法应包括以下部分：样品收集技术、高分辨电泳装置、自动化凝胶染色仪、半自动化图像分析软件、机器人模拟的斑点处理过程、MALDI-TOF和串联质谱仪，并且具有整合的生物信息学软件，可以链接到单个模块并进行畅通的样品处理、追踪、数据分析和数据归档。

（6）蛋白质定量的问题

在蛋白样品水合前，一般需要测定样品中蛋白含量。*常用方法用Bradford法测定蛋白浓度。由于蛋白样品含有去污剂如SDS和还原剂DTT等物质,因此,用此法测定蛋白浓度线性关系差，测定结果出现偏差,给不同样品或处理条件下蛋白表达差异比较带来误差。目前，一些公司已经开发了蛋白定量测定试剂盒，提高样品中蛋白定量的准确性。

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