激光共聚焦显微镜概述

　　激光共聚焦显微技术(Confocal laser scanning microscopy)是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本(例如细胞)进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点(焦点)进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。

　　激光共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。

激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史

　　1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的**。

　　1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff**展示了改善了分辨率的共焦显微镜。

　　1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了**台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜

　　80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。

　　近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。

激光共聚焦显微镜(LSCM)的原理

　　激光共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。

　　传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

　　从基本原理上讲, 激光共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:

　　1.用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

　　2.采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差

　　3.激光共聚焦显微镜采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

　　4.用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图

　　在激光共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说LSCM是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的**结合,是现代技术发展的必然产物。

激光共聚焦显微镜的技术指标

　　1)激光器部分：LD405nm 405nm 50mw;MAr: 458、488、515nm 40mW, He-Ne Green :543nm 1mW; LD Red:635nm 20mW，各激光器单独分立，整合输出。

　　2)共聚焦部分：

　　扫描速度4000线/秒，输出速度》4000MHZ。

　　光谱扫描分辨率《2nm，步进《1nm，光谱扫描速度100nm/1msec。

　　具有光子记数功能，取图激光强度《0.1%。

　　*新离子沉淀镀膜滤光片，增强性PMT。

　　局部放大扫描(ZOOM)1X—50X，高度自动化的预览扫描功能。

　　可以升级到双扫描头，方便进行FRAP、FRET、UNCAGE等光漂白、光刺激工作。

　　3D取图控制软件，支持多种3D观察方式，如：鼠标任意拖放;同时支持3D测量功能。

　　3)显微镜部分：

　　高精度Z轴马达步进《10nm。

　　双层光路设计，出光口9个，可以在显微镜侧口、后口等部位安装CCD等其它取图仪器。

　　荧光光源100W汞灯，光纤导入式，减少汞灯产热对显微镜机架的热漂移。

　　4)计算机部分：

　　高性能主流图像工作站，高速接口卡，可选配各种大容量外部存储设备及输出设备。CPU：E6550(2.33GHz)，内存: 2G,硬盘: 320GB,光驱:DVD-R/RW;FV1000 特殊I/F板(内置),图像处理卡: ATI RADEON HD 2400PRO

　　5)防震台及稳压电源系统：

　　高性能气垫式防震台和稳压电源系统，保证仪器使用过程中良好的稳定性。

　　6)高精度XY电动载物平台。

激光共聚焦显微镜的优势

　　一、人眼分辨率： 0.2mm

　　光学显微镜分辨率：0.25μm

　　电子显微镜分辨率：0.2nm

　　共焦显微镜分辨率：0.18mμm

　　二、电子显微镜的缺陷：

　　1.只能观察固定样品

　　2.样品制备过程(固定、包埋、切片)造成的假象

　　二、荧光显微镜的缺陷:

　　1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。

　　2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。

　　3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。

　　4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。

　　三、激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别

　　1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像

　　2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片

　　3. 增加侧向分辨率

激光共聚焦显微镜的设计特点

　　1.点照明。

　　2.具有照明pinhole和探测pinhole。

　　3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。

　　4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 。

　　5.具有多个(五个) 荧光通道，可同时探测多个被标记物 。

　　6.使用AOTF(Acousto-Optical Tunable Filter )进行激光波长和强度的选择，并以极超快速控制激光开和关，从而实现任意形状感兴趣区域扫描的功能,实现了实时快速检测。

　　7. AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)：更好的减少了激发光对发射荧光的干扰。

　　8.光谱检测器：任意选择接受光谱的波长和带宽。

激光共聚焦显微镜的使用

　　1、根据标本选择的荧光探针对激发波长选择激光器类型。

　　2、根据荧光探针的发射波长选择相应的滤片，K凌镜无滤片扫描则不需要这一步。*好根据现有仪器配制选择荧光探针。

　　3、根据实验目的选择合适当软件。一般仪器的软件分静息状态度图像分析软件、动态测量软件和特殊软件。

　　4、激光共聚焦显微镜按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。

激光共聚焦显微镜用途及应用范围

　　观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。

　　细胞形态学分析(观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征;半定量**荧光分析);荧光原位杂交研究;基因定位研究及三维重建分析。

　　激光共聚焦显微镜系统应用领域涉及医学、动植物科研、生物化学、**学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。

　　应用范围：

　　一、细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞结构和发布变化。

　　二、生物化学：酶、核酸、FISH(荧光原位杂交)、受体分析。

　　三、药理学：**对细胞的作用及动力学。

　　四、生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布动态。

　　五、神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布。

　　六、微生物学和寄生虫学：**、寄生虫形态构成。

　　七、病理学及临床应用：活检标本的诊断、肿瘤诊断、自身**性**的诊断、HIV等。

　　八、遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断。

激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用

　　一、激光共聚焦显微镜在细胞及分子生物学中的应用

　　1. 细胞、组织的三维观察和定量测量

　　2. 活细胞生理信号的动态监测

　　3. 粘附细胞的分选

　　4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能

　　5. 光漂白后的荧光恢复

　　6. 在细胞凋亡研究中的应用

　　二、激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用

　　1. 定量荧光测定

　　2. 细胞内离子的测定

　　3. 神经细胞的形态观察

　　三、激光共聚焦显微镜在耳鼻喉科学中的应用

　　1. 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用

　　2. 激光共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用

　　3. 激光共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用

　　4. 激光共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用

　　四、激光共聚焦显微镜在肿瘤研究中的应用

　　1. 定量**荧光测定

　　2. 细胞内离子分析

　　3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析

　　4. 三维重建

　　五、激光共聚焦显微镜在***领域的应用

　　1. 细胞内钙离子的测定

　　2. **荧光定位及**细胞化学研究

　　3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜

　　六、激光共聚焦显微镜在血液病研究中的应用

　　1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用

　　2. 在细胞凋亡研究中的应用

　　七、激光共聚焦显微镜在眼科研究中的应用

　　1. 利用激光共聚焦显微镜观察组织、细胞结构

　　2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现

　　3. 利用激光共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态

　　4. 三维重建

　　八、激光共聚焦显微镜在肾脏病中的应用

　　激光共聚焦显微镜可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。