布氏杆菌简介

　　布氏杆菌属(Brucella)是一类革兰氏阴性的短小杆菌，牛、羊、猪等动物*易感染，引起母畜传染性流产。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地。我国部分地区曾有流行，现已基本控制。布氏杆菌也是帝国主义者列为失能性生物战剂之一。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊(Br.melitensis)、牛(Br.Bovis)、猪(Br.suis)三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病*为多见。

布氏杆菌感染及表现

　　布氏杆菌首先感染家畜。家畜临床表现不明显。但怀孕的母畜则极易引起流产或死胎，所排出的羊水、胎盘、分泌物中含大量布氏杆菌，特别有传染力。而其皮毛，尿粪，奶液中均有此菌。排菌可长达三个月以上。人通过与家畜的接触，服用了污染的奶及畜肉，吸入了含菌的尘土或菌进入眼结合膜等途径，皆可遭受感染。发病年龄大多在30岁以上。

　　该菌自损伤的皮肤及粘膜或消化道，呼吸道进入人体后，首先被吞噬细胞吞噬，进入**结，有时可在其中存活并生长繁殖形成感染灶，约2～3周后可进入血液循环产生菌血症。继之在网状内皮系统如肝，脾，骨髓内生长形成新的感染病灶，并可多次反复冲破细胞进入血循中，则再一次引起菌血症和临床急性症状，表现为平均2～3周的发烧期，每间隔约3天至两周，发烧又反复，产生波浪状的热型，故称为波浪热。

　　同时，布氏杆菌含有内**及菌体本身皆可引起人体的过敏，出现各种的变态反应性病变。骨关节病变，多发生在半年左右，少数病例更早些。布氏杆菌骨髓炎是血源性布氏杆菌感染在骨关节的局部表现。任何骨均可受累，但以脊椎炎*为多见。关节的病变常侵犯大关节，以髋关节炎*为常见。

　　大多数病人有急性感染表现。主要为波浪状发烧为其特点，发烧约2～3周，继之1～2周无烧期，以后再发烧。常伴多汗，**，乏力，游走性***(主要为大关节)。有时全身症状消退后，才出现局部症状。腰椎受累后，出现持续性腰背痛，伴肌肉痉挛，活动受限后，影响行走。常可产生坐骨神**。局部有压痛及叩痛，少数病人于髂窝处可扪及脓肿包块;也可产生硬膜外脓肿压迫脊髓及神经根，出现感觉、运动障碍或截瘫。同时可伴有肝、脾肿大，区域性**结肿大等表现。

　　慢性病人可伴有其它多处的关节病变。但大多数发生在腰椎，少数发生在胸椎，胸腰段，骶椎或骶髂关节者。男性病人可有睾丸肿大，睾丸炎症表现。本病有“自愈”趋势，但历时较长。未接受**者复发率约占6%～10%。

布氏杆菌的检测

　　1、传统的检测方法

　　1.1 **学检测

　　布氏杆菌需在实验室里进行。初步分离时,须在5%~10%二氧化碳环境中方能生长,而且标本中必须存在大量活菌才能分离到该菌,培养**的周期长,需要花费大量的时间才能得出结果。因此在布病的检测中已经逐渐被淘汰。

　　1.2 血清学检测

　　该法同样要在实验室才能操作,虽然凝集试验(agglutination test)操作简便,且所需时间短,但由于IgM在pH为中性或弱酸性时凝集*活跃,所以凝集试验会因为抗体交叉反应而易出现假阳性反应。判断结果有很大的误差, 在2000年被 OIE 取消了其作为布氏杆菌病的检测方法。沉淀试验(Precipitationtests)是可溶性抗原与相应抗体结合,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的白色沉淀,由于是人为的观察结果,因此存在很大的主观性,有时会因出现交叉反应而误判结果,且有很大的局限性,不是一种理想的检测布病的方法。补体结合试验(complement fixation test,CFT)主要用于检测牛、绵羊、山羊和猪的布氏杆菌病,在操作过程中对温度和滴加试剂的量有很高的要求,需要很多控制条件, 结果也无法避免假阳性的影响。放射**试验是1977年Parratt建立起来的,由于在该实验中要用大量的放射性元素会对人体和环境造成很大的威胁, 因此该法一直没有得到广泛运用。

　　1.3 变态反应检测

　　临床上可用布氏杆菌水解素 0.2ml 注射于动物根皱褶处, 24h 及 48h 各观察一次, 若注射部位发**胀即判为阳性反应。此法对慢性病例检出率较高,并且注射水解素后无抗体产生,不妨碍以后的血清学检查。此法主要用于山羊和绵羊检疫,但山羊的变态反应试验不如绵羊变态反应试验那样易读取结果,对中、后期病山羊的诊断意义较大, 适用于山羊布氏杆菌病的筛检,不作个体山羊的诊断依据。

　　2、酶联**吸附试验

　　ELISA是**技术中应用*广的一种, 在适合的载体上, 酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原-抗体**复合物, 在一定的底物参与下, 复合物上的酶催化底物, 使其水解、氧化或还原成另外一种带色物质。由于在一定条件下,酶的降解底物和呈现 色泽是成正比的,因此,可以应用酶测定仪进行测定,从而计算出参与反应的抗原和抗体的种类和含量。自从1971年Engvall等和Van Weemen等分别报道酶联**吸附试验(enzyme linked immunoassay assay, ELISA)以来, ELISA得到了很大的发展,到目前其类型也很多, 在此对常用的两种介绍如下。

　　2.1 间接酶联**吸附试验__1976年Carlsson**次建立间接ELISA( indirectenzyme linked immunoassay assay, IELISA)法检测人布氏杆菌病,之后在多种动物上用该法检测布氏杆菌病。1995 年F.Bianciflori等用间接ELISA从羊奶中检测布氏杆菌病,其特异性和敏感性都特别高;1996年F.A.Uza等人用抗IgG1的单克隆酶轭合物间接ELISA诊断牛布氏杆菌病,检测了三组血清,**组是没有注射疫苗的阴性血清,**组是注射了疫苗的阴性血清,第三组是来自阳性牛的血清。间接ELISA检测的特异性前两组分别是99.2%和99.6%,间接ELISA检测阳性血清的敏感性是99.5%;得出IELISA的敏感性和特异性都很高;1998年V.R. Vanzini等评价了间接 ELISA在阿根廷奶牛中用奶和血清检测诊断布氏杆菌病的效果, 在来自相同奶牛的奶和血清中间接 ELISA检测的特异性和敏感性分别为:奶样敏感性为99.6%特异性为99.1%;血清的敏感性为99.6%特异性98.6%。奶和血清的敏感性相同而奶的特异性比血清的高。 说明可以在检测奶牛布氏杆菌病的时候可以用奶代替血样,排除了采血带来的麻烦,大大地提高了检测效率。2004赵云玲等人分别通过琥红凝集试验( RBPT)、试管凝集试验( SAT)、和酶联吸附( ELISA)试验检测某牛厂送检 202 份血清和 129 份乳清, 所得的实验结果说明乳清完全可以代替血清用于牛布氏杆菌病的血清学检测; 2001年V.R.Vanzini等人比较了在大量奶样中用间接 ELISA和用乳汁环状试验检测流产性布氏杆菌抗体的差异,*后得出间接ELISA的敏感性( 98.1%)高于乳汁环状试验( 72.2%),而间接ELISA的特异性(88.1%)低于乳汁环状试验(90.5%),间接ELISA的敏感性比乳汁环状试验的高出很多,特异性和乳汁环状试验的差不多。2004 年 C.Saegerman等人评价了用单克隆抗体和蛋白G作为过氧化轭合物的三种血清间接 ELISA 诊断牛布氏杆菌病的效果,得出间接 ELISA 的敏感性和特异性都非常的高。2004年刘耀兴等人对牛布 氏杆菌病间接 ELISA 与血清试管凝集试验(SAT)、琥红平板凝集试验( RBPT)、缓冲平板凝集试验( BPAT)进行了临床运用比较。结果表明间接 ELISA 和其他三种检测方法阳性和阴性符合率为100%, 但间接ELISA法较SAT、RBPT、BPAT方法先进、快速、结果客观 可靠。根据使用的不同抗原、抗球蛋白酶结合物和底物或色原体产生了多种间接 ELISA。有几种商用间接ELISA在广泛的田间试验中得到验证并推广使用。虽然间接 ELISA是高度敏感的方法, 但是它不能把S19疫苗**产生的抗体与致病株感染引起的抗体区别开来。 因此, 更多地把间接ELISA作为普查检测方法而不是作为**家畜的检测方法。

　　2.2 竞争酶联**吸附试验

　　传统的血清学检测方法和间接 ELISA方法无法鉴别疫苗**产生的抗体和致病株感染引起的抗体。为了把这两种抗体鉴别开来出现了竞争酶联**吸附试验(competitive enzyme linked immunoassay assay,CELISA) 。1995 年 K.H.Nielsen 等用脂多糖作为抗原固定在聚苯乙烯基质上和O- 型多糖( OPS)表位特异性单克隆抗体( M84)作为抗体, 羊抗鼠IgG 抗体酶轭合物作为检测抗体, 用这种调整的 CELISA检测注射S19 疫苗牛的抗体和感染牛布氏杆菌牛的抗体。检测了1446个来自未感染布氏杆菌群的血清,其特异性为 99.7%; 检测了636份来自感染布氏杆菌群的血清,其敏感性为100%。这种方法的主要原理是疫苗**引起的低亲合力的抗体是由于**消除引起的短暂暴露抗原所引起的,而持续抗原田间感染中, 抗体的亲合力是不断升高的。这样竞争性抗体就能有选择地抑制结合疫苗所产生的抗体而不是野毒株所产生的抗体。因为CELISA可以消除因接种疫苗而产生的残余抗体所引起的大部分反应, CELISA 对牛布氏杆菌OPS表位特异性单克隆抗体有很高的特异性, 所以单克隆抗体的选择及其独有的特异性和亲和力对CELISA法的诊断有明显的影响。酶联**吸附试验(ELISA)具有很强的敏感性和特异性,它既可检测IgG 和IgM,又可检测IgA 类抗体。CELISA 法还适用于鉴别自然感染与人工**病例。但目前尚无公认的诊断标准。它和平板反应法相比,二者的特异性都很高,识别阳性和阴性血清能力几乎为100%, 但ELISA 法的敏感性远远高出平板反应法, 研究证明一般高出3~4 倍。

　　3、分子生物学检测方法

　　3.1 PCR法自从1978年以来许多检测布氏杆菌的基础 PCR 得到了发展, *早检测布氏杆菌的基础PCR是针对布氏杆菌上高度保守的单个基因( 如 BCSP31 和 16SrRNA 基因) 而设计的。主要是用于鉴定布氏杆菌种的类型, 1990 年 Fekete **次报道了 PCR 基础诊断方法, 这种方法扩增了 635bp 的编码 43-KDS19 牛布氏杆菌外膜蛋白序列, 他们都能够证明这种方法对布氏杆菌的特异性, 也可以应用于所有的物种和亚种, 其敏感性特别好( 不少于 100 种**) 。然而, 由于所有权的原因引物和靶序列没有发表, 但他们的成功很大程度上鼓舞了人们进一步用 PCR 对布氏杆菌病的检测。接着被探索的基因靶子是 16SSrRNA, 1992 年Herman and De Ridde 根据流产性布氏杆菌16S系列设计一对引物, 成功地扩增了从牛布氏杆菌和其他布氏杆菌种中预计的 800bp 的序列, 证明了这些序列具有高度的保守性, 并且这种检测可以延伸到全基因。1992 年 Baily 根据编码 BCSP31 的基因建立了一种新的 PCR, 这种 PCR 分析法设计了专一的一对低聚核甙酸引物, 扩增了223bp 的产物。并且证 明了对于牛布氏杆菌和羊布氏杆菌的敏感性和特异性都非常的高。 2002 年 E.Navarro 等用 PCR 扩增了人布氏杆菌的三个不同的基因, 这三个基因分别是编码牛布氏杆菌抗原 31kDa 的基因、牛布氏杆菌 16SrRNA 序列和编码外膜蛋白的基因。它们对检测提纯的布氏杆菌 DNA 显示出不同的敏感性( 8fg~20pg) 。在中国也有学者对布氏杆菌的 PCR 检测方 法有所研究, 1999 年金红等建立了 IS6501 锚定PCR法, 这种方法可用于鉴定布氏杆菌并区分不同毒株和生物型, *具有意义的是可鉴别野毒株与疫苗株; 2003年王胜昌等根据编码31kDa布氏杆菌蛋白的基因(BSCP31), 设计两对引物。对布氏杆菌 R 型(粗糙型)抗原及 S 型(光滑型)抗原、大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌分别采用两种提取、纯化 DNA 的方法, 并以纯化的各**DNA为摸板, 分别进行内、外引物 PCR 反应及套式PCR反应,反应时以**超纯水作为空白对照。结果显示:进行内、外引物PCR反应和套式 PCR 反应时, 布氏杆菌R型及 S 型均出现预期的扩增带594bp、460bp及460bp, 且套式扩增后条带亮度明显增强,而作为验征PCR特异性或对照的大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿腺杆菌、**超纯水均无扩增带。验证敏感性时用外引物对布氏杆菌 R 型、S型DNA进行扩增后,*低可检测到1pg的布氏杆菌DNA。