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碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（冰冻切片专用） BA2320/BA2350/BA23100

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产品价格： < 面议
产品型号：BA2320/BA2350/BA23100
品 牌：biobox
公司名称：南京碧波生物科技有限公司
所 在 地：江苏南京
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产品简介

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

产品详细信息


碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（冰冻切片专用）
      
一、产品简介
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，*后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于冰冻切片组织样本的凋亡原位检测。
本试剂盒有如下优点：
1、   高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
2、   操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有DAB。
3、   特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
4、   快速：仅需约3个小时即可完成。
5、   方便观察：使用光学显微镜观察实验结果，无需贵重设备。
二、试剂盒组份
组   份
Cat: BA2320
Cat: BA2350
Cat: BA23100
储存条件
平衡液
1.0 mL
2.5 mL
5.0 mL
-20℃
TdT酶
80μL
200μL
400μL
-20℃
Streptavidin-HRP
10μL
25μL
50μL
4℃避光
Biotin-dUTP
20μL
50μL
100μL
-20℃
DAB
2mg
5mg
10 mg
-20℃避光
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：
-20℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，*好同时检测多个凋亡指标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。
5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液*好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。
8、为了您的**和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及**试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1、   对于冰冻切片
a、    把冰冻切片浸入固定液，室温（15-25℃）固定30min。
 （固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）
b、   把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、    把b步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
d、   把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、    把d步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min
（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
f、    然后转入B步骤标记和显色反应。
     2、阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
        a、阳性对照样本的准备
           样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温～37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9，10 mM NaCl，6mM MgCl2，10mM CaCl2）
b、阴性对照样本的准备
在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、 标记和显色反应：
1、   预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
 参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
 
1个样品
5个样品
10个样品
平衡液
45µl
225µl
450µl
Biotin-dUTP
1µl
5µl
10µl
TdT酶
4µl
20µl
40µl
TdT酶反应液总体积
50µl
250µl
500µl
3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）
4、   把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、   Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制：
 Streptavidin-HRP工作液的配制：
参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
 
1个样品
5个样品
10个样品
Streptavidin-HRP
0.5µl
2.5µl
5µl
PBS
99.5µl
497.5µl
995µl
Streptavidin-HRP工作液总体积
100µl
500µl
1000µl
DAB工作液的配制：
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
DAB
2mg
5mg
10mg
PBS
0.2ml
0.5ml
1.0ml
 
配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存
b、DAB工作液的配制：
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
 
1个样品
5个样品
10个样品
20×DAB（10 mg/ml）
5µl
25µl
50µl
30％H2O2
1µl
5µl
10µl
PBS
94µl
470µl
940
DAB工作液总体积
100µl
500µl
1000µl
 
6、   将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
7、   把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
8、 将第7步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显**况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。
9、   把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。
10、选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色­­­­­ 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡­­­­­5min。用二甲苯浸泡­­­­­10min，更换二甲苯后再浸泡­­­­­10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。

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