碱性磷酸酶染色（NAP）

1. 简介

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP或AKP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RN**段的5'-P末端转换成5'-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5与AKP6六种同功酶。其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有*大活力，对来源于**中的ALP来说，其*适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。

2. 临床意义

碱性磷酸酶（ALP）是诊断胆道系统**时常用的指标。临床上测定ALP主要用于骨骼、肝胆系统**的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断。对于不明原因的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。高值可能说明有肝脏异常或胆管阻塞现象；低值更多出现于儿童和孕妇身上。高值表明有可能发生了活动性骨沉积，因为ALP是成骨细胞活动的副产物。一般来说，低值要比高值少见。碱性磷酸酶指标低也可以见于慢性肾炎，贫血，甲状腺机能不全等。此外，碱性磷酸酶偏低在肝病患者朋友们也是比较常见的，此时需要引起重视。

3. 测定原理

ALP检测一般采用钙钴法。碱性磷酸酶在pH 9.0～9.8的条件下，能使β-甘油磷酸磷酸磷酸钠水解，生成磷酸钠，经与钙离子作用生成磷酸钙，再与钴离子作用生成磷酸钴，*后与硫化铵生成黑色硫化钴沉淀，定位于酶活性所在部位。

4. 实验步骤

（1）对于细胞样本，制成细胞涂片，然后置于固定液中固定；对于石蜡切片，常规脱蜡水洗；冰冻切片 6-8 um；

（2）切片或细胞涂片水洗数秒；
（3）将切片或细胞涂片放入新鲜孵育液中37℃孵育，冰冻切片10―30min，石蜡切片或细胞涂片1―2 h；

（4）取出后用蒸馏水稍洗；
（5）侵入硝酸钴水溶液中处理5 min，然后迅速用蒸馏水冲洗；
（6）侵入新鲜配制硫化铵溶液中处理10 s，流水冲洗干净；
（7）冰冻切片和细胞涂片用甘油明胶固定；石蜡切片常规脱水、透明及封固；

（8）镜下观察。

结果：阳性反应呈灰黑色至深黑色颗粒状或片块状沉淀，定位于胞浆中。

5. 注意示项
（1）试剂质量、温度、pH 及固定液对碱性磷酸酶活性均有影响，因此必须注意，孵育液pH要严格控制好，pH高时，酶扩散细胞有破溶现象，黑色颗粒散于细胞外；
（2）固定液不能单独用甲醇作固定剂，因为对酶有抑制作用；
（3）涂片应新鲜，厚薄适宜，标本存放过久，酶活性降低。涂片经温育后，不要经水冲洗，直接加硝酸钴液，否则，阳性程度减弱，或导致假阴性。

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