组织**荧光（IF）---双标

1. 原理
       **荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查组织内的相应抗原（或抗体）。在组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。**荧光技术分直接法、间接法和补体法，*常见的为间接法。
      在同一细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色，称为**荧光双标。用未标记的两种特异性**抗体孵育细胞，洗去多余的**抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的**抗体孵育细胞，洗去多余的**抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性**抗体必须来源于不同种属，且荧光标记**抗体的种属必须与**抗体的种属相匹配。
2. 实验步骤
（1）石蜡切片脱蜡至水，或者制作的冰冻切片用冷丙酮在4℃固定10－20分钟；
（2）抗原修复，冰冻切片无需修复；
（3）用0.01M PBST漂洗3次，每次5 min；
（4）滴加正常的血清室温封闭30 min；
 （5）加未标记的特异性混合一抗体，4℃过夜；
（6）用0.01M PBST漂洗3次，每次5 min（震荡漂洗）；
（7）加荧光标记的混合二抗抗体，37℃湿盒避光作用30 min；
（8） 0.01M PBST避光漂洗3次，每次5 min；
（9）甘油缓冲液封片；
（10）荧光显微镜观察。
3. 注意事项
（1）荧光染色后一般在1 h内完成观察，或于4℃保存4 h，时间过长，会使荧光减弱；
（2）每次试验时，需设置以下三种对照：
        阳性对照：阳性血清+荧光标记物
        阴性对照：阴性血清+荧光标记物
        荧光标记物对照：PBS+荧光标记物；
（3）加入荧光二抗后，操作尽量在暗室中进行；
（4）抗体浓度和孵育时间需要事先摸索；
（5）两种一抗要来源于两种不同的动物；
（6）二抗用两种不同荧光信号标记，且各自信号相互不干扰或干扰性小。

1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上；

2.取材切面要平整，厚度不宜超过2mm；

3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。

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