实验外包-流式细胞仪原理及步骤

 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于**学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、**瘤作用迅速正确的诊断，对**细胞群和亚群进行**分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞**荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞**荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接**荧光的结果。

(一)  原理

   活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的**抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 

(二)  操作步骤    

 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、   

 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)                

   ↓        

         用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为      

5×10６～１×10７／ml            

              ↓       

     取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)      

     的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS      

   稀释)灭活正常兔血清                 

 ↓4℃ 30min     

用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右           

            1000rpm×5min              

        ↓         

         弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠       

(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇                

     ↓ 4℃ 30min      

       用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右        

               1000rpm×5min          

                    ↓     

       加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入       

 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，   

 视细胞浓度加入100～500μl固定液)              

            ↓         

 FCM检测或制片后荧光显微镜下观察      

     (标本在试管中可保存5～7天)   

(三)    试剂和器材  

1.    各种特异性单克隆抗体。 

2.    荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠**抗体，灭活正常兔血清。

3.    10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 

4.    玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四)    注意事项  

1.    整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。  

2.    洗涤要充分，红外碳硫仪以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.    加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面**球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。  

4.    细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 

 附:    1. DPBS (×10, 贮存液)  

   NaCl 80g   

 KCl 2g      蒸馏水加至1000ml   

 Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释    

 KH２PO４ 2g 

2. 洗涤液   

 DPBS      900ml   

 FCS 50ml (终浓度 5％)   

 4％NaN３   50ml (终浓度0.2％) 

 3. 固定液   

  DPBS    1000ml   

葡萄糖    20g (终浓度2％) 

  甲 醛    10ml   

   NaN３   0.2g (终浓度0.02％

上海拜沃生物科技有限公司专业实验外包-流式细胞仪检测服务，详情请咨询。

咨询方式

电话： 55890177

联系人：李波 

在线QQ：516260426