实验外包-激光扫描共聚焦显微镜原理

 实验外包-激光扫描共聚焦显微镜原理

激光扫描共聚焦显微镜工作原理

激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近为0%），因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干扰，使得它具有比普通显微镜更高的分辨率，并在生物学中获得了广泛的应用。

实验外包-激光扫描共聚焦显微镜原理

激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，利用计算机进行图像处理，对观察样品进行断层扫描和成像，是一种高敏感度与高分辨率的显微镜，在生命科学领域的组织、细胞 和分子水平研究中的应用十分广泛，主要用于样品荧光定量检测，共聚焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和细胞间通讯等方面研究。

激光扫描共聚焦显微镜以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源，  经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。

激光扫描共聚焦显微镜通过对样品X-Y轴的逐点扫描，形成二维图像。如果在z轴上调节聚焦平面的位置，连续扫描多个不同2位置的二维图像，则可获得一系列的光学切片图像。在相应软件的支持下，通过数字去卷积方法(deconvolution)得到清晰的三维重建图像。正因为激光扫描共聚焦显微镜能沿着z轴方向在不同层面上获得该层的光学切片，所以可以得到组织细胞各个横断面的一系列连续光学切片，实现细胞“CT”功能。
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