碧波TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光法）（冰冻切片） BA2720/BA2750/BA27100
产品简介
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-f
产品详细信息
碧波TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）（冰冻切片专用）
一、产品简介
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于组织样本（冰冻切片）的凋亡原位检测。
本试剂盒有如下优点：
1、高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
2、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
3、快速：仅需约3小时即可完成。
4、操作简单：使用Ready-to-Use型试剂，并配有DAB。
5、方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果，亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。
二、试剂盒组份
|
组 份
|
Cat: BA2720
|
Cat: BA2750
|
Cat: BA27100
|
储存条件
|
|
平衡液
|
1.0 mL
|
2.5 mL
|
5.0 mL
|
-20℃
|
|
荧光标记液
|
20μL
|
50μL
|
100μL
|
-20℃避光
|
|
TdT酶
|
80μL
|
200μL
|
400μL
|
-20℃
|
|
anti-fluorescein antibody
|
200μL
|
500μL
|
1000μL
|
-20℃避光
|
|
DAB
|
2mg
|
5mg
|
10 mg
|
-20℃避光
|
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、荧光显微镜、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：
-20℃保存，荧光标记液和DAB需避光保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，*好同时检测多个凋亡指标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。
5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液*好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。
8、为了您的**和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及**试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1、 对于冰冻切片
a、 把冰冻切片浸入固定液，室温（15-25℃）固定30min。
（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、 把b步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min
（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
f、 然后转入B步骤标记和显色反应。
2、阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下��方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
a、阳性对照样本的准备
组织样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、阴性对照样本的准备
在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、标记和显色反应：
1、 预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
|
|
1个样品
|
5个样品
|
10个样品
|
|
平衡液
|
45µl
|
225µl
|
450µl
|
|
荧光标记液
|
1µl
|
5µl
|
10µl
|
|
TdT酶
|
4µl
|
20µl
|
40µl
|
|
TdT酶反应液总体积
|
50µl
|
250µl
|
500µl
|
3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
可进一步用DAB进行染色观察
6、 anti-fluorescein antibody及DAB工作液的配制：
anti-fluorescein antibody工作液的配制：
参考下表配制适量的anti-fluorescein antibody工作液，需充分混匀。注意：配制好的anti-fluorescein antibody工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
|
|
1个样品
|
5个样品
|
10个样品
|
|
anti-fluorescein antibody
|
10µl
|
50µl
|
100µl
|
|
PBS
|
40µl
|
200µl
|
400µl
|
|
Streptavidin-HRP工作液总体积
|
50µl
|
250µl
|
500µl
|
DAB工作液的配制：
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
|
DAB
|
2mg
|
5mg
|
10mg
|
|
PBS
|
0.2ml
|
0.5ml
|
1.0ml
|
|
|
配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存
|
||
b、DAB工作液的配制：
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
|
|
1个样品
|
5个样品
|
10个样品
|
|
20×DAB（10 mg/ml）
|
5µl
|
25µl
|
50µl
|
|
30％H2O2
|
1µl
|
5µl
|
10µl
|
|
PBS
|
94µl
|
470µl
|
940
|
|
DAB工作液总体积
|
100µl
|
500µl
|
1000µl
|
7、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL anti-fluorescein antibody工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
8、 把第7步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
9、 将第8步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显**况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。
10、把第9步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。
11、选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5min。用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片
关于我们|
易展动态|
易展荣誉|
易展服务|
易家文化|
英才集结号|
社会责任|
联系我们
备案号：粤ICP备11010883号|
公安机关备案号：44040202000312|
版权问题及信息删除： 0756-2183610
QQ：
Copyright?2004-2017 珠海市金信桥网络科技有限公司 版权所有
