DiBAC4(3) 25 mg

　　英文名：Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol

　　结构式：

　　分子式：C₂₇H₃₉N₄O₆

　　分子量：515.62

　　性质：

　　1. 外观：红色粉末

　　2. 纯度：≥98% (HPLC)

　　3. 产品描述：

　　DiBAC4(3)是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，它本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。DiBAC4(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化;反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。

　　4. 溶解及使用方法：

　　可以使用DMSO、无水乙醇和纯水溶解，用DMSO溶解成10mM的母液储存，如果低浓度也可以满足要求也可用纯水溶解。

　　I. 用荧光显微镜测定膜电位的方法

　　(1)试剂

　　·DiBAC4(3)

　　·Dulbecco’s MEM (DMEM)

　　·FBS (fetal bovine serum)

　　(2)方法

　　1) 将消化好的细胞移至DMEM中。

　　2) 加入FBS，控制浓度范围在：2～15% 。

　　3) 加入DiBAC4(3)，控制浓度范围在：1～5 µmol/L。

　　4) 用荧光显微镜观察刺激后荧光强度的变化。[Ar激光(488 nm) 的激光共聚焦显微镜]，由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变，所以必须在37℃的条件下测定。由于细胞膜的电位会变化，可以观察细胞质内的荧光强度变化。

　　II. 用酶标仪测定膜电位的方法

　　(1)试剂

　　·DiBAC4(3)

　　检测用缓冲液 (pH7.4; 20 mmol/L HEPES, 120 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 2 mmol/L CaCl₂, 1 mmol/L MgCl₂,5 mmol/L glucose)

　　(2)方法

　　1) 培养细胞：在微孔板中培养细胞

　　2) 清洗细胞：用含5 µmol/L DiBAC4(3) 的检测用缓冲液200 µL，清洗微孔板中培养的细胞2次

　　3) 染色：在孔板中加入180 µL含5 µmol/L DiBAC4(3) 的检测用缓冲液，在5%CO₂，37℃培养箱中孵育30分钟。

　　4) 测定：用荧光酶标仪观察刺激后荧光强度的变化。由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变，所以必须在37℃的条件下测定，加入20 µL含DiBAC4(3) 的检测用缓冲液，每隔30秒测定1次荧光变化。

　　III. 膜电位的标准曲线

　　(1)原理

　　膜电位变化时色素的分布也随之变化，所以荧光和吸收也会变化。这种变化程度取决于色素的分子数和细胞数的比率、色素的浓度以及细胞的种类。膜电位的标准曲线是通过用电极直接测定目的细胞的膜电位，在该电位所测得的荧光和吸收强度而制得的。

　　(2)试剂

　　·DiBAC4(3)

　　·Eagle-Dulbecco medium

　　·PBS

　　(3)方法

　　1) 用Eagle-Dulbecco medium培养细胞。

　　2) 取PBS中的细胞在37℃的CO₂培养箱中孵育30～60分钟，然后改变孵育时间，制备不一样的CO₂浓度的样品。

　　3) 加入DiBAC4(3)，终浓度为2 µmol/L。

　　4) 20分钟后，在517 nm测定各个浓度的荧光强度，并用电极直接测定此时的电位差。

　　5) 用荧光强度和对应的电位差来制作标准曲线。

　　(4)其他方法

　　有钾扩散电位和荧光或吸收强度比较的方法。缬氨霉素引起钾扩散电位，钾扩散电位 (V) 是按照Nernst 方程计算如下：

　　V= -RT/F log[K+]in/[K+]out = -59 log[K+]in/[K+]out (mV)

　　所以在缬氨霉素存在时，通过改变细胞外钾离子浓度和细胞内钾离子浓度，计算扩散电位，测定各个电位的荧光或吸收强度，比较后可以得到标准曲线。

　　储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。