1. 原理
样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离,以石油醚萃取后,用正相色谱柱提取富集,用反相色谱柱,紫外检测器定量测定。
2. 适用范围
本方法来源于GB/T5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素d、维生素E的测定;也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。
3. 主要仪器
1) 高压液相色谱仪" target="_blank" href="http://www.18show.cn/product/st597.html">液相色谱仪,具有可变波长的紫外检测器,数据处理系统或记录仪" target="_blank" href="http://www.18show.cn/product/st96.html">记录仪。
2) 旋转蒸发器。
3) 平底烧瓶:250mL。
4) 分液漏斗:500mL。
4. 试剂
所有试剂,如未注明规格,均指分析纯,所实验用水均指蒸馏水。
1) 异丙醇:色谱纯。
2) 2%焦性没食子酸乙醇溶液:取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。
3) 75%氢氧化钾溶液:取75g氢氧化钾溶于100mL水中。
4) 石油醚:沸程30~60℃。
5) 甲醇:色谱纯。
6) 正己烷:色谱纯。
7) 环己烷:色谱醇。
8) 维生素D标准溶液
A. 维生素D2标准贮备液:含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2,用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B.维生素D3的标准贮备液:含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3,用甲醇定容于100mL容量瓶中。
5. 操作步骤
5.1样品处理:准确称取10g样品,于250mL平底烧瓶中,加30mL蒸馏水。
5.2测定液的制备:
1)于上述样品溶液中加入100mL的20%没食子酸乙醇溶液,充分混匀后加50mL75%氢氧化钾溶液,在蒸汽浴上边续回流30min后,立刻冷却到室温。
2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中,用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。
3) 于上述分液漏斗中,加入100mL石油醚,盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1min.在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层,将水相放入另一500mL分液漏斗中,重复上棕萃取过程2次,合并醚液到**个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近于(绝不允许蒸干)后,用石油醚转移至10mL容量瓶中,定容。
4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中,用氮气将石油醚吹干,于试管中加1mL正己烷。
5.3测定:
1) 测定液的制备:
A) 仪器条件:
色谱柱:30cm×40cm,硅胶柱。
流动相:正己烷与环己烷按体积比1:1混合,并按体积分数0.8%加入异丙醇。
流速:1mL/min。
波长:265nm。
柱温:20℃。
灵敏度:0.005AU/MV。
注射体积:200mL。
B)注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液,根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中,将试管用氮气吹干,准确加入0.2mL甲醇溶解。
2) 测定步骤:
A) 仪器条件:
色谱柱:4.6mm×25cm,C18或具同等性能的色谱柱。
流动相:甲醇。
流速:1mL/min。
波长:265nm。
柱温:20℃。
灵敏度:0.005AU/MV。
注射体积:50mL。
B) 注射50mL维生素D标准溶液,注射50mL样品溶液,得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。
6. 计算
ρs×10∕7×40×100
X =
m
As
ρs= ---×ρsd
Asd式中: X--样品维生素D的量,mg/100g;
m--称样量,含量,IU∕100g;
ρs --进样液中维生素D有浓度,mg/mL;
A s --进样液中维生素D有峰高(或峰面积);
A s d --标样液中维生素D有峰高(或峰面积);
ρsd --标样中维生素D的浓度;
计算结果**至小数点后一位。
7. 注意事项
1) 允许误差及*小检出量:同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10%;*小检出量为0.1国标单位。
2) 试剂焦性没食子酸容易变性,应购习近期生产的试剂。
3) 如果皂化不完全,可适当增加氢氧化钾的加入量。
食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定