范围

　　本标准规定了牛奶中氯霉素残留量检测的制样和高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)测定方法。

　　本标准适用于牛奶中氯霉素的残留量测定。检出限为0.05μg/L。

　　规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本适用于本标准。

　　GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISO/IECDirectives，Part3，1997，RulesforthestructureanddraftingofInternationalStandards，NEQ)

　　GB/T6682-1992分析实验室用水规则和试验方法

　　农牧发[2003]1号兽药残留试验技术规范(试行)

　　制样

　　样品的制备

　　取适量新鲜的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀、密封。

　　样品的保存

　　-20℃以下冰箱中贮存备用。

　　测定方法

　　方法提要或原理

　　牛奶中的氯霉素用乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，氮气吹干。用高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

　　试剂和材料

　　以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的**水。

　　氯霉素标准品(CAP)含氯霉素(C11H12Q5N2Cl2)不得少于97%

　　乙酸乙酯

　　乙腈色谱纯

　　甲醇色谱纯

　　正己烷

　　氯化钠

　　氯霉素标准贮备溶液取氯霉素标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释成浓度为100μg/mL的标准贮备液，置-20℃保存，保存期不超过一年。

　　氯霉素标准溶液准确量取氯霉素标准贮备溶液适量，用50%乙腈稀释成浓度为5μg/L的标准溶液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过一个月。

　　4%的氯化钠溶液称取40.0g氯化钠，加水稀释成1000mL，摇匀即得。

　　WatersSep-PakVacC18固相萃取柱或相当者500mg，3mL。临用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润。

　　仪器和设备

　　液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源)或相当者

　　实验室常规仪器设备

　　天平感量0.01g

　　分析天平感量0.00001g

　　漩涡混合仪

　　振荡器

　　组织匀浆机

　　冷冻离心机" target="_blank" href="http://www.18show.cn/product/st688.html">离心机

　　固相萃取装置

　　旋转蒸发仪

　　氮吹仪

　　离心管50mL、20mL

　　微孔滤膜0.22μm

　　测定步骤

　　试料的制备包括：

　　——取冷冻样品于室温解冻，将解冻后的样品于-8℃，6000r/min离心20min，作为供试样品。

　　——取冷冻空白样品于室温解冻，将解冻后的空白样品于-8℃，6000r/min离心20min，作为空白样品。

　　——取空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加样品。

　　提取

　　取10.0mL供试样品，置50mL离心管中，加入20mL乙酸乙酯提取，震荡15min，以6000r/min离心10min，将乙酸乙酯层移至鸡心瓶中。再加20mL乙酸乙酯同法操作，合并两次乙酸乙酯提取液至鸡心瓶中，于45℃水浴中减压旋转蒸发至干。

　　净化

　　加10mL4%氯化钠溶液于鸡心瓶中，充分旋涡溶解残留物，加5mL正己烷振荡混合1min，静置分层，弃去正己烷。再加5mL正己烷，同法操作。水层为样品备用液。

　　用5mL甲醇、5mL水淋洗活化C18柱，弃掉洗涤液。取上述水层备用液，以每3～4秒1滴的流速通过预处理后的C18柱，用5mL水洗柱，弃去洗液，抽干。用5mL甲醇洗脱并收集洗脱液，氮气吹干，用1mL50%乙腈溶解残余物，充分涡旋，用0.22μm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

　　标准曲线的制备

　　准确量取适宜浓度的氯霉素标准容液，添加到通过提取、净化后的空白样品洗脱液中，用氮气吹干，用1mL50%乙腈溶解残余物，充分涡旋，用0.22um滤膜过滤，，制得浓度为0.20μg/L、0.50μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的系列标准工作溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

　　测定

　　液相色谱条件

　　色谱仪：Waters_2695高效液相色谱仪" target="_blank" href="http://www.18show.cn/product/st597.html">液相色谱仪或相当者

　　色谱柱：AtlantisTMC18(2.1mm×150mm，5μm)或相当者

　　柱温：30℃

　　流速：0.2mL/min

　　进样量：20μL

　　运行时间：15min

　　流动相：A：乙腈，B，水

　　GradienTable

　　Time(min)FlowRate(mL/min)A(%)B(%)Curve

　　Initial0.220801

　　60.290106

　　80.290106

　　150.220801

　　质谱条件

　　质谱仪：WatersQuattroPremierXE或相当者

　　电离模式：ESI-

　　扫描方式：负离子扫描

　　检测方式：多反应检测

　　电离电压：2.8KV

　　源温：120℃

　　雾化温度：350℃。

　　锥孔气流速：50L/h;

　　雾化气流速：450L/h;

　　数据采集窗口：15min

　　驻留时间：0.2sec

　　测定法

　　取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算，即得。对照溶液及试样溶液中氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

　　空白试验

　　除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

　　结果计算和表述

　　按下式计算试样中氯霉素的残留量：

　　式中：

　　X——试样中氯霉素的残留量(ng/mL);

　　A——试样溶液中氯霉素的峰面积;

　　AS——标准溶液中氯霉素的峰面积;

　　cs——标准溶液中氯霉素的浓度(ng/mL);

　　V——溶解残余物的体积(mL);

　　V0——供试牛奶试样的体积(mL)。

　　注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。

　　检测方法灵敏度、准确度、精密度

　　灵敏度

　　本方法在牛奶中的检测限为0.02μg/L，*低检出限为0.05μg/L。

　　准确度

　　本方法在牛奶中0.05μg/L～0.2μg/L添加浓度的回收率为50%～120%。

　　精密度

　　本方法的批内变异系数CV≤14.8%;批间变异系数CV≤23.9%。