外源DN**段在质粒载体中的克隆

分子克隆技术中常见实验为利用质粒载体克隆外源DN**段。实验中需进行质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。


外源DN**段在质粒载体中的克隆-实验材料：外源片段来自一个含有水稻DN**段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。

外源DN**段在质粒载体中的克隆-实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

外源DN**段在质粒载体中的克隆实验步骤：
1．载体pUC18和外源DN**段的限制性酶切：
 （50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）：
   DNA 30 ml
   R.E 1 ml
   10×buffer 5 ml
    ddH₂O 14 ml
    37℃反应1hr，分别取8 ml 外源片段酶切产物和5 ml PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA

2．加入ddH₂O 150 ml （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；
3．吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上；
4．12000g 4℃冷冻离心15分钟；
5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH₂O（1.5ml tube中）；
6．按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50℃反应30 min 以上
     DNA 20 ml
    CIAP（TaKaRa） 0.5 ml
    10 ´ buffer 4.0 ml
    ddH₂O 15.5 ml

附注：
1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。
2.克隆中用到的几种工具酶：
（1）限制性内切酶
限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在50 ml反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1mg DNA完全切割所需要的酶量。
限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。
（2）碱性磷酸酶
**碱性磷酸酶（BAP）(拜力生物**供应 胶原酶I型 )和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其可在70℃ 10’内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比BAP的高10－20倍。它主要用于：（1）克隆时去除载体的5’-P，以防载体自连；（2）在用 Kinase进行5’末端标记前，去除DNA的5’-P。
（3）连接酶
体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是**的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。
3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、**镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重**。操作时应戴手套、**镜、穿防护服，并在通风橱中进行。

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