水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）

   DNA 分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的 DNA 。

水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）实验目的：了解植物 DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。

水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）实验材料及试剂： 水稻叶片， 1.5 × CTAB ，氯仿 / 异戊醇 (24:1) ， 95% 乙醇或无水乙醇等

水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）实验原理：植物 DNA 的抽提常采用两种方法：
  （1） SDS 法： 离子去污剂，过程长，纯度高；
  （2） CTAB 法：该方法简便、快速， DNA 产量高 ( 纯度稍次，适用于一般分子生物学操作 ) 。 CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在 CTAB 的处理下， 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来 。 CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐 （ >0.7mM ） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度 （ 0.1-0.5mM NaCl ） 下 CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后， CTAB- 核酸复合物再用 70 － 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。 再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，*后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。

水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）实验步骤：

1．采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末， 0.4 g 装入 1.5ml 离心管中（ -20 ℃预冷）。
2．预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。
3．立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下颠倒 1 次。
4．12000g 离心 5 min。
5．吸取上清液约 600μl ，加入等体积（ 600μl ）氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。
6．12000g 离心 5 分钟。
7．取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH₄AC ，混匀，室温放置 10min 。
8．12000 g 离心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。
9．加入 50μl 1/10 TE 或无菌水（含 20μg/RNase ），置于 4 ℃过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。

水稻总 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）注意事项：

1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的β -ME 处理
2．研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化
3．24:1 的氯仿 / 异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头*好是剪宽了的
4．所用试剂必需**，手套

分子克隆技术中常见实验为利用质粒载体克隆外源DN**段。实验中需进行质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。 

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