GIBCO血清培养乳鼠心肌细胞技术

材料：乳鼠（1-3d）

试剂：DMEM/F12（gibco），FBS（四季青），0.125%混合酶（胰酶和胶原酶1），GIBCO血清

器材：高压包1（眼科剪、镊2套，200目滤网1个），高压包2（消化用小锥形瓶及转子和盖子，9cm平皿1套，100ml烧杯2个），高压包3（小纱布块，细胞计数板），离心管（nunc，15ml，无菌），吸管（一次性单包装无菌，碧云天），酒精棉球，75%酒精1瓶，口罩，帽子，手套，mark笔，离心机，超净台，培养箱，磁力搅拌器（可控温），水浴锅，消化水浴杯（内有300ml双蒸水），卧式染色缸1套（取心用），自制小支架2个（垫平皿用）。
（值得注意的是我所用的装培养基的瓶子都是蓝色丝口瓶，这种瓶子瓶口大，相对来说不容易污染。）

关键词：多次消化，病从口入

步骤：

一、准备
1.  带口罩、帽子，洗手，入培养室
2.  酒精棉球擦拭超净台后，放高压包123和离心管、吸管、酒精棉球缸于超净台内；
3.  放75%酒精1卧式染色缸一套（打开盖）、mark笔于超净台外，放消化水浴杯于磁力搅拌器上（开机，温度37度，转速小于100）在超净台外；
4.  放15%完全培养基和消化酶于水浴锅内（开机，温度37度）
5.  开超净台和培养室紫外30min。

二、30min后
1.带手套，洗净滑石粉，烘干后入培养室，关紫外，开超净台风机，酒精擦手。
2.取4度不完全培养基置于超净台上，取平皿分为两个，每个里面各放一套器械，然后各加不完全培养基8ml，取100ml烧杯一个。将100ml烧杯和其中一个平皿放在超净台外的桌子上，100ml烧杯中倒入75%酒精。
3.拿镊子夹乳鼠，在烧杯中浸泡5-10秒，然后置于杀鼠台上（就是卧式染色缸的盖子），剪刀撕开皮肤，开胸（注意不要损伤消化道），除心包，挤压后取心，直接取心室肌，置于装有4度不完全培养基的平皿中。以此类推，直至全部取完。
4.只将有心肌的平皿放回超净台，酒精擦手。
5.用第2套剪刀先略微剪一下，基本上把每个心脏剪成两半，目的在于先跑跑血。然后，小心移入另一个平皿，简单冲洗后，留下少许液体，猛剪，直到您满意为止。然后再用不完全培养基洗三遍。用吸管移植消化用锥形瓶。
6.加入消化酶10ml，水浴杯内消化10-15min，**次弃上清；剩余组织中再次加入混合酶继续磁力消化，静置后将上清液移入含15%FBS的DMEM/F12培养基的离心管终止消化，4℃保存；剩余组织用同样方法反复消化，直至消化完全。1 200 r/min离心10 min，弃上清，用培养液制成单细胞悬液，接种于25 cm培养瓶
7. 37度、5% CO2培养箱中孵育1.5 h，吸出细胞悬液离心，细胞计数板计数，调整细胞浓度为1-5×106个/ml后接种于培养瓶和铺有爬片的6孔板。
8. 24h后观察，期间不要看细胞。24h即可见同步搏动了。

三、收拾培养室，写实验记录。


(拜力生物 GIBCO血清  )