stoelting脑立体定位仪使用实例
摘 要：本文旨在探讨N - 甲基-D - 天冬氨酸( N -methyl- D -aspartic acid, NMDA) 受体与神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)在慢性应激抑郁发生中的作用与关系。建立慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS) 抑郁模型，海马单侧分别微量注射非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801、NPY-Y1 受体阻断剂GR231118 和NMDA后，利用体重测量及糖水偏爱测试、强迫游泳及敞箱实验等方法观察动物行为变化，运用**组织化学方法检测海马CA3 区和齿状回(dentate gyrusDG) 内NPY的表达。结果显示，CUMS组大鼠表现出抑郁样行为变化，海马NPY表达显著降低；海马微量注射NMDA或NPY-Y1 受体阻断剂GR231118 ，动物行为学表现均与CUMS 组相同，注射NMDA可使NPY表达显著降低；海马微量注射MK-801 能明显改善应激引起的抑郁样行为表现，并使海马NPY表达增加。联合注射GR231118与MK-801 后，GR231118 可以显著减弱MK-801的抗抑郁样行为的效应。以上结果表明，CUMS 可能使谷氨酸(glutamic acid, Glu) 过量释放，NMDA受体过度激活，抑制NPY表达，导致抑郁发生。NPY抗抑郁作用主要是通过NPY-Y1受体实现。
关键词：慢性不可预见性温和应激；抑郁；海马；NMDA 受体；神经肽Y
抑郁征是一种慢性、易复发的情感障碍性综合征。应激性生活事件是抑郁征的明显促发因素，慢性、低强度、长期的日常生活事件是引发抑郁征的主要原因，而作用于动物身上的各种长期应激因素，可以模拟人类抑郁征的发生。已发现慢性应激可导致动物行为活动减少，并伴有情绪低落等抑郁症状。目前国内外广泛应用慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)模型进行抑郁征发病机制及抗抑郁**的药理学研究。
在抑郁征的研究中，海马成为备受关注的脑区。海马与情感、情绪密切相关，富含各种神经递质及受体，是参与应激反应的*重要脑区之一，也是易造成应激损伤的主要靶器官，慢性应激可引起海马结构和功能的改变。而在应激造成海马损伤的过程中，谷氨酸(glutamic acid, Glu) 作为一种神经递质充当了重要角色。
目前，Glu及其N - 甲基- D - 天冬氨酸( N-methyl-D -aspartic acid, NMDA) 受体因与多种神经**如抑郁征等相关而被广泛关注。NMDA受体阻断剂及其相关**已被证实具有抗抑郁作用。Rangon (2007)对幼鼠的研究发现CUMS 可增加NMDA的结合位点。严进等研究表明，应激使大鼠海马Glu水平显著增高，NMDA受体过度激活从而造成兴奋性神经毒性作用，与多种神经**有关。基于 Glu及其受体变化研究抑郁发生已成为目前研究的热点。
神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)广泛地分布于**及外周神经系统，是哺乳动物神经系统内含量*多的肽类之一，在很多神经核团和脑区作为神经调质来调节其它神经递质的合成和释放。应激能引起NPY分泌，NPY的抗应激作用明显超过了其它内源性化合物。单相难治性抑郁征病人脑脊液中NPY水平较正常人明显降低。CUMS 可以使NPY的表达下降。此外，单侧背部海马重复注射NPY能够抑制或阻断CUMS 引起的抑郁症状。NPY的主要受体有NPY-Y1、2 、
4 、5 四种类型，其中NPY-Y1 受体是被完整NPY分子活化的受体，药理学的研究证明NPY-Y1受体介导NPY抗焦虑和抗抑郁作用。尽管对于NPY、Glu及其NMDA受体研究比较多，但已有的研究成果仅停留在对 Glu和NMDA受体与抑郁征的关系以及NPY与抑郁征关系的探索，而对海马中NMDA 受体与 NPY 之间的关系还存在争议。我们猜想应激性抑郁发生的机制之一是CUMS 诱发Glu过量释放从而过度激活了NMDA受体，导致NPY表达量下降。为了证明以上猜想，我们通过建立CUMS 抑郁动物模型，海马微量注射NMDA、NMDA受体阻断剂及NPY-Y1 受体阻断剂，用糖水偏爱测试、敞箱实验和强迫游泳等方法观测动物行为学表现，并检测大鼠海马 CA3 区和齿状回(dentate gyrus, DG) 的NPY蛋白表达的变化，探讨在应激性抑郁发生中Glu的NMDA受体与NPY的关系，为抑郁发生机制的研究提供新的思路。
1 材料与方法stoelting脑立体定位仪使用实例
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只(250~300 g) ，由陕西省中医研究院实验动物中心提供。实验前饲养一周以适应环境，自由进食饮水。动物随机分为6 组，每组10只：A 组为对照组，正常饲养，每周海马微量注射生理盐水；B 组为CUMS 模型组，每周海马微量注射生理盐水；C 组为NMDA组，每周海马微量注射 NMDA(5 μ g/ μ L) ；D 组为CUMS+MK-801组，CUMS 模型，且每周海马微量注射MK-801(0.5 μ g/ μ L)；E 组为GR231118组，每周海马微量注射 GR231118(5 μg/ μL) ；F 组为CUMS+ GR231118+MK-801组，CUMS 模型，且每周海马联合注射GR231118 (2.5μ g/ μ L)与MK-801 (1 μ g/ μ L) 各0.5 μ L 。A~D组，进行行为学测试，并且用**组织化学方法检测
NPY 在海马的表达情况。E~F 组只进行行为学实验。
1.2 实验材料 NPY抗体由美国Connecticut 大学神经科学实验室馈赠。SABC **组化染色试剂盒购于武汉博士德生物技术工程有限公司，DAB试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司生产。NMDA、非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801、NPY-Y1 受体阻断剂GR231118 为美国Sigma 公司产品。 脑立体定位仪 (51600)为美国Stoelting 公司产品。微量注射器(1 μ L) 为上海安亭微量进样器厂产品。
1.3 方法
1.3.1 脑立体定位及海马微量注射 大鼠实验前自由饮水，禁食18~24 h 后手术。以****纳40mg/kg 腹腔注射麻醉，将大鼠固定于立体定位仪，参照Paxinos&Watson 大鼠脑图谱，向大鼠海马处(AP 3.8 mm, RL 2.5 mm, H 2.5 mm) 植入一直径0.9 mm 带有内芯的不锈钢套管，用磷酸水门汀固定。术后3 天每天腹腔给予青霉素2 万单位，自由饮食，一周后海马微量注射**。在实验的第1 、7 、14、21天海马微量注射**，采用微量注射器(1 μ L) 匀速给药，1 min 内注完，停针1 min 防止**外溢。注射时管芯伸出套管外1.6 mm，到达海马。实验结束后，取脑行冠状切片观察套管轨迹，定位不准确者弃去。
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只(250~300 g) ，由陕西省中医研究院实验动物中心提供。实验前饲养一周以适应环境，自由进食饮水。动物随机分为6 组，每组10只：A 组为对照组，正常饲养，每周海马微量注射生理盐水；B 组为CUMS 模型组，每周海马微量注射生理盐水；C 组为NMDA组，每周海马微量注射 NMDA(5 μ g/ μ L) ；D 组为CUMS+MK-801组，CUMS 模型，且每周海马微量注射MK-801(0.5 μ g/ μ L)；E 组为GR231118组，每周海马微量注射 GR231118(5 μg/ μL) ；F 组为CUMS+ GR231118+MK-801组，CUMS 模型，且每周海马联合注射GR231118 (2.5μ g/ μ L)与MK-801 (1 μ g/ μ L) 各0.5 μ L 。A~D组，进行行为学测试，并且用**组织化学方法检测
NPY 在海马的表达情况。E~F 组只进行行为学实验。
1.2 实验材料 NPY抗体由美国Connecticut 大学神经科学实验室馈赠。SABC **组化染色试剂盒购于武汉博士德生物技术工程有限公司，DAB试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司生产。NMDA、非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801、NPY-Y1 受体阻断剂GR231118 为美国Sigma 公司产品。 脑立体定位仪 (51600)为美国Stoelting 公司产品。微量注射器(1 μ L) 为上海安亭微量进样器厂产品。
1.3 方法
1.3.1 脑立体定位及海马微量注射 大鼠实验前自由饮水，禁食18~24 h 后手术。以****纳40mg/kg 腹腔注射麻醉，将大鼠固定于立体定位仪，参照Paxinos&Watson 大鼠脑图谱，向大鼠海马处(AP 3.8 mm, RL 2.5 mm, H 2.5 mm) 植入一直径0.9 mm 带有内芯的不锈钢套管，用磷酸水门汀固定。术后3 天每天腹腔给予青霉素2 万单位，自由饮食，一周后海马微量注射**。在实验的第1 、7 、14、21天海马微量注射**，采用微量注射器(1 μ L) 匀速给药，1 min 内注完，停针1 min 防止**外溢。注射时管芯伸出套管外1.6 mm，到达海马。实验结束后，取脑行冠状切片观察套管轨迹，定位不准确者弃去。
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