**分子生物技术

简介：

人体内的细胞遇抗原时, 会受刺激繁殖, 而产生大量有专一性的抗体(monoclonal antibody). 而抗元常引起不同的B细胞产生抗体, 故在血液中的抗体实际上是多元性抗体(polyclonal antibodies), 其原因是此抗元常含有不只一处致抗体的部位(epitopes), 每个部位都可引起一个不同B细胞抗体.

抗体有五种, IgG, IgA, IgD, IgE及IgM, 对同一个人而言, 此5种抗体均对同一抗元有作用. 抗体的形状如Y字形, 有二条轻鍊, 二条重鍊. 轻鍊又有K和λ二种, (但同一抗体只含其一), 但重鍊则只有一种. 即IgG是γ, IgA是α, IgD是δ, IgM是μ, IgE是ε.

不论轻, 重鍊均含有变异端(variable region)与恆常端(constant region), 与抗元作用的部分是在轻, 重鍊变异端的高度变异(hypervariable region)部分, 大约站15Å×20Å×15Å的空间大小.

抗体之所以能有如此多变化, 并非人的基因有如此大量, 而是在B细胞成熟过程中, 其基因重组(有很多恆常端, 变异端, 连接端, 变化diversity端的基因, 可以重组排列), 可以构成不同的抗体.

将酶衔接至抗体之技术

将酶衔接至抗体上, 是使酶(例如horweradish peroxidase HRPO, 或alkaline phosphatase)与抗体形成稳定的. 且不影响酶与抗体之功能.

以HRPO衔接为例, 其化学变化如下：

此一技术, 可用于Enzyme-linked immounoworbent assay (ELISA)及western boltting, 其方法如下：

材 料：

1mg/ml antibody solution

0.1M phosphate buffer, pH6.8

Horseradish peroxidase (HRPO)

0.1M Carbonate buffer, pH9.2

Sodium periodate (NaIO4) solution, freshly prepared

Sodium borohydride (NaBH4) solution, freshly prepared

Saturated ammonium sulfate (NH4)2SO4 solution

Tris/EDTA/NaCl (TEN) buffer, pH7.2

BSA

Glycerol

Dialysis membrane

Pasteur pipet fitted with glass wool

Sephadex G-25, medium

方 法：

1.     将1mg/ml抗体以2公升0.1M phosphate buffer pH6.8透析, 过夜,     4℃ 缓缓搅拌. (抗体量可以A280/1.44＝mg Ig/ml来计算) (透析膜影    50﹪ethanol浸一小时, 再以10mM NaHCO3浸一小时, 再以1mM EDTA浸一小时, 再以dH2O冲洗, 再保存在phosphaed buffer中, 4℃, 为防**生长, buffer中可加入0.01﹪的sodium azide).

2.     溶10mg的GRPO于1ml的0.1M carbonate buffer, pH9.2中.

3.     将0.25ml新配好的NaIO4液与0.25ml的10mg/ml HRPO/carbonate液溷合, 盖紧盖子, 置室温2hr(避免光照).

4.     在一支Pasteur pipette中放入适量glass wool, 将出口处以parafilm包好, 再将1ml以透析过的antibody液, 加入0.5ml的10mg/ml HRPO液中, 再将0.25g的Sephadex G-25加入此antebody/HRPO溷合液中 (此一步骤可增进酶与抗体之结合). 将此溷合物加入此Pasteur pipette中.

5.     置于暗室, 室温3hr.

6.     将此Column以0.75ml的Carbonate buffer将conjugate洗出, 保存.

7.     在此释出液中, 加入38μl的新配好之NaBH4液, 在室温, 暗室, 置30min.

8.     再加入112μl的NaBH4液, 暗室, 置60min.

9.     再加入饱和0.9ml (NH4)2SO4液, 缓缓搅拌30min, 4℃, 离心15min, 10,000xg.

10.倒去上清, 将沉淀物溶于0.75ml的TEN中.

11.透析此液, 4℃, 2公升的TEN, 过夜, **天换过一次TEN液, 再透析4hr.

12.将透析膜内物取出, 加入适量BSA, 使此液中*终BSA量为20mg BSA/ml.

13.加入等量之glycerol并保存在-20℃.

配方：

0.1M Carbonate buffer, pH9.2：

1.36g Sodium carbonate

7.35g Sodium bicarbonate

950ml H2O

以1M HCl或1M的NaOH调整pH至9.2再加dH2O使体积成为1公升.

0.1M phosphate buffer, pH6.8：

保存A溶液：0.2M：31.2g NaH2PO4于1公升的dH2O中

保存B溶液：0.2M：28.39g NaH2PO4于1公升的dH2O中

溷合51ml的A液与49ml的B液, 及100ml的dH2O成为使用溶液.

饱和ammonium sulfate (NH4)2SO4液：

将1.21g Tris base加入990ml dH2O中, 使成0.01M Tris液, 调整pH至7.0, 再加dH2O, 使总体积为1公升, 量767g的(NH4)2SO4加入此Tris液中,搅拌, 并加为热, 使溶, 调整pH至7.0, 并保存在4℃, (NH4)2SO4的结晶会沉淀出来.

Sodium borohydride (NaBH4)液：

5mg NaBH4/ml dH2O, 必须用前才配

Sodium periodate (NaIO4)液：

1.71mg NaIO4/ml dH2O (用前才配)

Tris/EDTA/NaCl(TEN)液, pH7.2：

在930ml dH2O中加入：

0.06g Tris base

0.37g Na2 EDTA

8.77g NaCl

调整pH至7.2(以HCl滴定)

加dH2O使体积成为1公升

附注：

1.    使用此法, 约1ng/ml至10ng/ml的抗元可以侦测到.

2.    在使用时, 可将结果稀释100至10,000倍. 是效果如何而定.

准备**抗元

材    料：

E.Coli(长于培养液中)

Cell resuspending buffer

Lysozyme solution

Tris/EDTA/NaCl(TEN) buffer

10﹪SDS

8M urea 

方    法：

1.     将5ml的E.Coli液在桌面离心机离心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 将沉淀**溶于5ml resuspending buffer中, 充分溷合(Votex).

2.     吸出1ml**液入1.5ml的微量离心管中, 置冰上再加入0.2ml的lysozyme液, 待5min.

3.     离心3,000rpm, 5min, 保留上层, 将沉淀物以1.2ml TEN溶解之. (因为有些蛋白质是不溶于水, 故二者均应保留)

4.     在每一种样本中各加入65μl的10﹪SDS, 置37℃, 10min, 此时样本即可使用, 若不使用应冷冻保存, 若有必要可以8M urea液(4.8g urea加入10ml液中), 处理蛋白质.

配方：

cell resuspending buffer (10mM HEPES)

2.38g HEPES

加dH2O或1 liter

附注：

1.     在**学实验中, Enzyme-Linked Immunolorbent Assays(ELISA)是常用于侦测**或抗元的方法. 一般分为直接法, 即将抗元放入micro titer plate, 使附着在内壁, 再以diluting buffer使未被附着处能不接受抗体附着, 接者加入已衔接酶的抗体, 再洗去多馀的抗体, 再加入酶的作用物, 使产生反应.

另一种为间接法, 即先将抗体放入micro titer plate中, 使与内壁附着, 再以diluitng buffer处理, 使未被附着的壁不会接受抗元, 再加入抗原始与抗体作用, 再洗去多馀的抗体, 再加入已衔接酶的抗元, 再洗去多馀的, 再加入酶的作用物使产生反应.

直接法的缺点是想测的有专一性的抗元须与其他杂质互争附于内壁, 以致有时量少, 而间接法则可选择性的留下受测的抗元.

2.     至于抗体, 可以用抗元配合adjuvat一同注射入体中, 4週后再增强注射一次, 2週后再增强一次, 以后每次抽血前7天注射一次即可取得含此抗体的血液. 此血液经离心, 保存血清, 再以ammonium sulfate沉淀抗体(约33﹪的浓度即可沉淀出IgG), 再离心, 保存沉淀物, 再透析去盐, 即可得抗体