枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

一、实验目的

1、观察D-半乳糖所致的小鼠老年痴呆的症状及探讨枫荷桂提取物、他克林的疗效的比较。

2、测定小鼠的学习记忆能力是否有所变化，同时测定其血液的SOD（超氧化酶歧化酶）活性及大脑匀浆胆碱酯酶的活性，并做海马区的老年斑测定。

二、实验原理

1、D-半乳糖腹腔注射可模拟AD氧化损伤，导致小鼠学习记忆下降、脑内胆碱能系统功能衰退、神经递质代谢异常、皮层和海马神经元损伤、超微结构和突触可塑性发生衰退性改变及Aβ淀粉样蛋白的沉积，病变与AD病变类似，可用于诱导建立AD模型鼠。

2、SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果，Aβ淀粉样蛋白的沉积会对大脑产生**作用，引起血液中SOD的改变。邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm)，同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量

3、血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后乙酰羟胺与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物，颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在520nm波长比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

4、Morris水迷宫测定小鼠的学习记忆能力，虽然老鼠是天生的游泳健将，但是它们却厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，他们会本能的寻找水中的休息场所。寻找休息场所的行为涉及到一个复杂的记忆过程，包括收集与空间定位有关的视觉信息，再对这些信息进行处理、整理、记忆、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隐藏在水中的站台，*终从水中逃脱。通过水迷宫视频分析系统能得到小鼠空间记忆的相关数据。

5、避暗法，穿梭箱为长方形盒（50cm×23cm×30cm），用一带门（7cm×5cm）隔板分成**区和电击区，电击区底部为可通电的铜栅栏（间隔0.5 cm），顶部有一声源，实验分为训练和正式测试两部分，挑选对电击反应较为一致的小鼠进行训练，将小鼠放入穿梭箱内适应环境1min，然后置于电击区，以声音为条件刺激，响10s后，以电击（40V）为非条件刺激，使小鼠逃向**区。训练期4d，每天10次，每次间隔2-3 min.d5进行正式测试，观察10次反应，在声音10s内进入暗室为主动回避反应阳性，记录从声音到小鼠进入暗室的时间（主动回避），10s内不主动回避，给以电击后进入暗室为被动逃避，记录被动逃避次数。通过此装置能得到小鼠受刺激记忆的数据。

6、AD主要表现为认知和记忆障碍，而认知和记忆障碍的主要解剖基础为海马组织结构的萎缩及病变，功能基础主要为胆碱能神经兴奋传递障碍和**神经系统内乙酰胆碱受体变性。胆碱酯酶抑制剂（如他克林）能改善**胆碱能神经功能。

6、阿尔茨海默(AD)的主要病理学特征是海马和皮层出现大量的细胞外老年斑(SP)。生化研究表明,SP的主要成分为-淀粉样蛋白(AP),它与AD的病理形成过程关系密切。老年斑为细胞外结构，直径为20~150μm，多见于内嗅区皮质，海马CA-1区，其次为额叶和颞叶皮质。其中心为淀粉样蛋白，周围由刚果红染色染成红色。

三、老年痴呆症状

   老年痴呆又称尔茨默病 （lzheimer' disease, D)是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性**神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid,β-AP)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque, P)的形成

四、**的疗效作用

1、他克林为胆碱酯酶抑制剂，能抑制血浆中的AchE,又可抑制组织中的AchE。能改善小鼠的学习记忆功能，且能有效的减少大脑老年斑的数量，以能提高血浆中SOD及乙酰胆碱的的活性。

2、枫荷桂的药效有实验结果数据分析得。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

五、实验材料

1、器材：鼠笼，注射器，试管，容量瓶，灌胃器，恒温水浴锅，紫外分光光度计，液体快速混合器，水迷宫视频跟踪分析系统，小鼠避暗仪，离心机，切片机，匀浆器。

2、药品：D-半乳糖，吡拉西坦，枫荷桂提取液

3、试剂：苦味酸; 三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、HCl、邻苯三酚; 酒精、冰醋酸、苏木精、甘油、钾矾（硫酸铝钾）、伊红、刚果红、甲醇、蛋白、水杨酸钠（防腐剂）、****钠、生理盐水、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、氢氧化钾、树胶、石蜡 ; 磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸羟胺，氢氧化钠，浓盐酸，三氯化铁，蒸馏水，乙酰胆碱，草酸钾。

4、动物:昆明品系健康小白鼠48只

六、实验方法

实验前准备

1、分组

小鼠48只，体重18~22g，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、枫荷桂提取物组、他可林组四个组，每组12只，对每组和每只小白鼠做好标记。实验前，将所有实验用的小白鼠在实验室内饲养1周，使其熟悉实验环境，自由饮水和取食， 饲养条件安静和较暗，室温20～25℃。

2、给药

①对照组灌胃生理盐水0.25lm/d，模型组、枫荷桂提取物组、他可林组均每日腹腔注射120mg/kgD-半乳糖，枫荷桂组每日按10g/kg灌胃，他可林组每日按3g/kg灌胃，进行30天，每3天测定一次小鼠的学习记忆能力，每天每只测2次。

②D-半乳糖注射液：可以网购的吧

枫荷桂：30g提取物溶于水中，定容到75ml得灌胃液。

  他可林：药店应该有得卖。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

③药品总量：

枫荷桂提取物：10g/kg×（0.02kg×10只）×30天=60g

他克林：3g/kg×（0.02kg×10只）×30天=18g

D-半乳糖：120mg/kg×（0.02kg×10只）×3组×30天=72g

3、取样

①血液及脑匀浆：每组取5只，小鼠禁食12h，断头处死，取血，之后取全脑(嗅脑除外)，置匀浆器中，加入预冷生理盐水制成10g／m1脑匀浆，3000r／min离心10min，取上清液置冰浴中，按部分测定方案测脑匀浆AchE、血液SOD活性。

②脑切片组织：，每组余下小鼠动物经1%****钠腹腔麻醉,剪开胸廓,经心尖插管至主动脉根部,先用生理盐水快速灌注冲洗,随后灌入固定液4%多聚甲醛,开颅取脑，置4%的甲醛溶液中固定24h。按石蜡包埋切片方法制备切片。

实验步骤

一、建模

   Morris水迷宫试验

1、大鼠在造模前均进行水迷宫游泳训练，训练至整个游泳从起始到找到平台所需时间连续3次都小于10s为获得记忆。

2、实验组小鼠每日按120mg/kg空腹腹腔注射D-半乳糖，连续注射4周。对照组注射等量生理盐水。

3、注射3周后对动物进行Morris水迷宫测试，在同一时间上再重新进行水迷宫游泳实验，小鼠寻找并爬上平台所需要的时间为逃避潜伏期，共3次，计算平均成绩。

注意：水迷宫实验环境要求安静，避免外界干扰，室内日光灯照明，水温25℃，一般时间选择在13：00—17：00，19：00—21：00。

避暗实验

正式实验前对各组小鼠进行训练，将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3min，然后给暗室铜栅通36V电流，小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5min，此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验，记录小鼠**次进入暗室的时间（避暗潜伏期），若小鼠5min内仍未进入暗室，其潜伏期计作300s。

二、采血测定SOD及胆碱酯酶含量

腹腔注射D-半乳糖之前对小鼠进行一次采血测定SOD及胆碱酯酶含量，作为空白对照。建模成功后，进行正常采血。

                   SOD含量的测定

1、邻苯三酚自氧化速率的测定

取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

2、SOD样液的活性测定

样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。

3计算

                 胆碱酯酶的测定

1、试剂配制

①磷酸盐缓冲液（PH=4.5）：准确称取4.156g磷酸氢二钠和1.3617g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释到500ml，保存冰箱内。

②碱性羟胺溶液：临用前将139g∕L盐酸羟胺溶液和140g∕L氢氧化钠溶液等体积混合。

③4mol∕L盐酸溶液：量取比重1.19的浓盐酸100ml，加蒸馏水至300ml。

④10%三氯化铁溶液：10g三氯化铁，加蒸馏水10ml，浓盐酸0.84ml，加蒸馏水至100ml，存于棕色瓶中备用。

⑤乙酰胆碱标准液：**称取乙酰胆碱1.，用磷酸缓冲液（PH=4.5）溶解，并稀释到100ml，此溶液1ml相当于70umol乙酰胆碱，为贮备液。临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液（PH=4.5）稀释10倍，此时溶液1ml相当于7umol乙酰胆碱，为应用液。2716g

⑥草酸钾抗凝剂：取草酸钾10g，加蒸馏水少许使溶解，再加蒸馏水至100ml。配制成10％水溶液，如每管加0.1ml则可使5~10ml血不凝。一般如作微量检验，用血量较少，可配制成2％溶液，如每管加0．1ml可使1~2ml血液不凝。

按照师姐的测定方法测定。

三、石蜡切片制备及老年斑染色

实验程序：

1、取材

采血测试完毕后,次日动物经1%****钠腹腔麻醉,剪开胸廓,经心尖插管至主动脉根部,先用生理盐水快速灌注冲洗,随后灌入固定液4%多聚甲醛,开颅取脑，置4%的甲醛溶液中固定24h。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的脑组织，切成一小块2~3mm厚。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

取材的注意事项：

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2、固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。

固定的注意事项：

（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3、 洗涤

材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。

4、 脱水

30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。

脱水注意事项：

（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

（2）在更换高**的脱水剂时，*好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高**脱水剂。

（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。

（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5、透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

6、透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石��渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；

（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速，力求在*短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

7、 包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。

用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

包埋的操作过程枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

8、 切片

①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。

⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

9、 贴片

①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成

均匀薄层。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。

③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸���水中3min。

染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。

11、染色

①刚果红染色：SP老年斑一般用刚果红染色，也可以用硝酸银染色。老年斑的染色方法是：Highman甲醇刚果红染色法。
1.甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
2.碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
染色步骤:1. 切片脱蜡至水2. 甲醇刚果红染液染10～20分钟3. 用碱性乙醇分化液分化数秒4. 水洗5. 苏木素复染2分钟6. 水洗. 脱水,透明,封固7结果：淀粉样物呈桔红色

②H.E.对染法：

1、切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

2、水洗

用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

3、分化

就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。

4、漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。

5、脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

6、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞

核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

7、脱水Ⅱ：

放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。*后用吸水纸吸干多余的乙醇。

12、透明

切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

13、封藏：中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是**保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。

封藏的方法：

封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

四、统计分析：所有数据以平均数和标准差表示，数据统计分析使用SPSS13.0统计软件进行组间t检测和单因素方差分析比较组间差异，p＜0.05为差异具有显著性，p＜0.01为具有非常显著的差异。

4、经费预算

①雌雄各半，小白鼠一只7元，48只就338元。路费一去一回（火车45+汽车65）110元。

②测AchE总需         ，测SOD总需，切片部分总需（有蛮多药品查不到价格，没有得出预算。）