摘 要:目的 制备白藜芦醇**(BTM)脂质体,对其质量特性进行评价,并考察脂质体对BTM的增溶作用。方法 采用薄膜分散法制备BTM脂质体,以包封率为评价指标,通过正交设计优化**工艺,微柱离心法测定其包封率,观察其形态、粒径及稳定性,并考察其对BTM的增溶作用。结果 优化的*佳**工艺:**与磷脂质量比为1∶20,胆固醇与磷脂比为1∶4,水化介质为5%甘露醇;按该**制备的脂质体包封率达(86.4±2.2)%;与游离BTM相比,BTM脂质体在水中的溶解度增大了1 012多倍。结论 采用*佳**制备得到的BTM脂质体包封率较高,形态和粒径较均匀,脂质体可以较好地提高BTM的溶解度。
关键词:白藜芦醇**;薄膜分散法;微柱离心法;包封率;正交设计
白藜芦醇**(3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene,BTM)是白藜芦醇的全甲基化衍生物,具有明显的抗新血管生成、抗有丝分裂作用,可以引起微管分解和微管蛋白解聚,用于抗肿瘤**。此外,BTM具有抗过敏、保护胃粘膜损伤以及抗衰老作用[1-3]。但是BTM难溶于水,光照下易发生异构化并降解,使其应用受到限制[4]。脂质体可以增加难溶性的**的溶解性,提高光不稳定***的光稳定性[5-6]。本实验将BTM制备成脂质体,对其**工艺和质量特性进行评价,并考察脂质体对BTM的增溶作用。
1 仪器与材料
LC20A—DAD高效液相色谱仪(日本岛津),N—1100 旋转蒸发仪(东京理化器械公司), Digital sonifier S — 450D 超声波细胞粉碎机(美国 Branson Sonifier ) , Nano—ZS90激光散射粒径仪(英国Malvern公司),Sirion 200场发射扫描电镜(荷兰FEI公司)。BTM对照品(质量分数99.2%,中南大学化学化工学院提供),BTM样品(中南大学化学化工学院提供),卵磷脂(S100,德国Lipoid公司),胆固醇(天津博迪化工有限公司),葡聚糖凝胶G-50(北京瑞达恒辉科技发展有限公司),乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 BTM脂质体的制备
采用薄膜分散法[7-8]。精密称取适量磷脂、胆固醇、BTM于茄形瓶中,加入10 mL氯仿溶解后,旋转蒸发除去氯仿,使形成均匀透明的薄膜,加入5%甘露醇溶液15 mL,45 ℃水浴下水化4 h,使薄膜溶胀充分水合完全,得乳白色混悬液;探头超声2 min,0.45 μm微孔滤膜挤出,即得BTM脂质体。
2.2 BTM定量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(75∶25),柱温30 ℃,体积流量1.0 mL/min,检测波长318 nm,进样量20 μL。
2.2.2 专属性试验 分别取空白脂质体、BTM乙腈溶液、BTM脂质体各0.2 mL,甲醇破乳并稀释至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样测定。结果表明,在此色谱条件下,脂质体辅料对BTM定量测定无干扰。
2.2.3 线性关系考察 精密称取BTM对照品10.0 mg于50 mL量瓶中,加乙腈溶解稀释至刻度,得质量浓度为200.0 μg/mL的BTM储备液。精密量取上述储备液适量,乙腈稀释成质量浓度分别为0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL的系列溶液,按“2.2.1”色谱条件进样分析,以色谱峰峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归,得回归方程A=134 298.1 C-588.8,r=0.999 9,表明BTM在0.1~32.0 μg/mL线性关系良好。
2.2.4 精密度试验 分别配制质量浓度为1.0、8.0、32.0 μg/mL的BTM乙腈溶液各5份,按“2.2.1”色谱条件测定,计算日内精密度和日间精密度。日内精密度RSD分别为0.27%、0.43%、0.19%,日间精密度RSD分别为1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 稳定性试验 取BTM脂质体混悬液适量,加甲醇稀释至质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液,按“2.2.1”色谱条件,在0、2、4、6、8、12 h分别测定BTM的峰面积,计算其RSD分别为1.38%、1.06%、0.59%,表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.6 重复性试验 取BTM脂质体混悬液适量,加甲醇稀释至浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液,按“2.2.1”色谱条件,连续测定5次,其质量浓度基本无变化,RSD分别为0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率试验 精密吸取0.2 mL空白脂质体于5 mL量瓶中,分别加入25、200、400 μL质量浓度为200.0 μg/mL的BTM乙腈储备液,加入甲醇破乳并稀释至刻度,重复3次,得质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的样品溶液,分别进样测定,计算回收率。3种质量浓度的回收率分别为101.3%、99.3%、99.6%,RSD分别为0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱离心法[9-11]测定BTM脂质体的包封率
2.3.1 微型凝胶柱的制备 称取葡聚糖凝胶G-50 1.0 g于适量蒸馏水中,浸泡24 h,沸水浴煮沸20 min,使葡聚糖充分溶胀并除去气泡。静置冷却后,装填于2.5 mL注射器(底部填有适量脱脂棉)中,于离心机中3 000 r/min离心5 min,备用。
2.3.2 洗脱曲线的考察 精密吸取BTM脂质体混悬液0.2 mL,加于微柱的顶部,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;重复以上操作。从第12管开始更换洗脱液,用乙醇-水(3∶2)混合溶剂代替蒸馏水作为洗脱液,操作同上,继续收集10管洗脱液。所收集的洗脱液用甲醇破乳并稀释定容至5 mL。按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定A B C 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
BTM质量浓度,以洗脱管号为横坐标,BTM质量浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线,结果见图2。可知脂质体在前8管基本洗脱完全,BTM游离**则在第13管以后被缓慢洗脱,可见葡聚糖G-50微型凝胶柱可较好地分离脂质体与BTM游离**。该方法可用于BTM脂质体包封率的测定。
2.3.3 包封率的测定 精密量取BTM脂质体混悬液0.2 mL于微柱中,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;重复以上操作。合并1~8管洗脱液,甲醇稀释破乳后定容至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定BTM质量浓度,记为C脂;另取BTM脂质体混悬液0.2 mL,加入甲醇超声破乳,破乳后甲醇定容至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定BTM质量浓度,记为C总,计算包封率。包封率=C脂/ C总C脂为包封于脂质体中的**质量浓度,C总为脂质体混悬液
中**的总质量浓度
2.4 单因素考察
2.4.1 药脂比对包封率的影响 固定胆固醇与磷脂的比为1∶3、水化介质为5%甘露醇、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取BTM与磷脂的质量比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制备脂质体,测定包封率分别为46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。结果表明,药脂比在1∶10以下时包封率可达70%以上。
2.4.2 膜材比对包封率的影响 固定药脂比为1∶20、水化介质为5%甘露醇、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取胆固醇与磷脂的比分别为1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制备脂质体,测定包封率分别为68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。结果表明脂质体的包封率随着胆固醇嵌入量的增加呈现先增加后减少的趋势。胆固醇对于脂质体起着膜流动性调节剂的作用,能适当提高**包封率和稳定性。但当胆固醇的量过大时,与脂溶***BTM竞争磷脂双分子层位置,导致包封率下降。
2.4.3 水化介质的种类对包封率的影响 固定胆固醇与磷脂的比为1∶3、药脂比为1∶20、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取水化介质分别为5%甘露醇、0.01 mol/L PBS、蒸馏水制备脂质体,测定包封率分别为78.2%、69.4%、72.7%。结果表明,水化介质为5%甘露醇时,脂质体的包封率*佳。
2.5 正交设计优化**
在文献资料[12]及单因素考察试验基础上,以包封率为指标,选择**与磷脂质量比(A)、胆固醇与磷脂比(B)、水化介质的种类(C)为考察因素,每个因素各取3个水平,进行正交设计,选用L9(34) 正交表安排试验,制备脂质体,测定包封率。。由正交试验结果分析可知,影响脂质体包封率的因素顺序为C>A>B,*佳**为A3B2C1,即**与磷脂比为1∶20,胆固醇与磷脂比为1∶4,水化介质为5%甘露醇。
2.6 *佳**工艺的验证
按上述筛选得到的*佳**,制备3批BTM脂质体混悬液(约相当于BTM 0.33 mg/mL),测定包封率分别为88.7%、84.3%、86.2%。3次验证试验的结果基本一致,说明所确定的优化**合理可行,重现性良好。
2.7 BTM脂质体形态
取*佳**制备的BTM脂质体适量,用超纯水稀释100倍,以扫描电镜观察脂质体形态。可见脂质体形态圆整,多为球形及类球形粒子,大小较均一。
2.8 粒径和Zeta电位的测定取*佳**制备的BTM脂质体适量,适当稀释后,用激光散射粒径仪测定脂质体的平均粒径和Zeta电位。脂质体的平均粒径为(183.6±2.1)nm,PDI为0.265±0.006,Zeta电位为(−15.3±1.2)mV。
2.9 初步稳定性考察
取*佳**制备的BTM脂质体3批,置于(4±1)℃冰箱中,于3、5、10 d取样,分别考察外观、粒径、Zeta电位和包封率的变化。结果BTM脂质体在4 ℃条件下放置10 d后,外观没有发生明可以看出,低温放置10 d,脂质体的外观、粒径及Zeta电位没有发生明显的变化,包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取过量的BTM原料药置于具塞试管中,加入超纯水,涡旋使分散均匀,于(25±1)℃的恒温振荡器中48 h,平衡后取样,用0.45 μm微孔滤膜过滤,按“2.2.1”下色谱条件进样分析,测得BTM在纯水中的饱和溶解度为0.32 μg/mL。取适量BTM脂质体于西林瓶中,加入10%蔗糖溶液作为冻干保护剂,冷冻干燥,得到冻干脂质体。取过量冻干粉于纯化水中,振摇复溶使分散均匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,加入甲醇破乳后,按“2.2.1”下色谱条件进样分析,测得BTM脂质体中**的饱和溶解度为324.2 μg/mL。BTM脂质体较其原料药在水中的饱和溶解度提高了1 012多倍,表明脂质体对BTM有较好的增溶作用。
3 讨论
BTM难溶于水,为脂溶***。薄膜分散法简单易行,适合于脂溶***脂质体的制备。本实验采用该法制备BTM脂质体,通过正交实验筛选*佳组成。制备过程中,成膜和水化是影响脂质体包0.1 1 10 100 1 000 粒径/ nm −200 −100 0 100 200Zeta电位/ mV 封率与粒径的关键步骤。成膜太厚、水化不完全,制得的脂质体粒径偏大,放置易聚集,影响脂质体的稳定性;成膜不均匀,导致**未能很好地嵌入脂质体双分子层中,影响脂质体的包封率。脂质体包封率的测定方法通常有凝胶柱层析法、透析法、超速离心法、微柱离心法等[9-11,13]。凝胶柱层析法消耗时间长,且不易控制洗脱液的体积流量;透析法消耗时间也较长;超速离心法要求较高离心力才能将脂质体和游离**分离。微柱离心法是一种快速、简便地分离脂质体中游离**的方法,其优点是脂质体混悬液几乎没有被稀释,可以避免脂质体的渗漏。本实验采用微柱离心法测定BTM脂质体的包封率,脂质体与游离**分离效果好,方法简便,重复性好。采用*佳**制备的3批脂质体,包封率较高,粒径分布均匀,重现性良好,并且可以显著提高BTM的溶解度���放置10 d后,外观和粒径均未发生明显的变化,但包封率略有降低,推测**可能出现渗漏。将脂质体冻干,可以显著降低磷脂的水解和氧化速率,提高脂质体的稳定性[14],实验拟进一步考察BTM冻干脂质体贮存稳定性。
参考文献
[1] Pan M H, Gao J H, Lai C S, et al. Antitumor activity of 3, 5, 4′-trimethoxystilbene in COLO 205 cells and xenografts in SCID mice [J]. Mol Carcinog, 2008, 47(3): 184-196.
[2] Li L, Luo X J, Liu Y Z, et al. The role of the DDAH-ADMA pathway in the protective effect of resveratrol analog BTM-0512 on gastric mucosal injury [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2010, 88(5): 562-567.
[3] Yuan Q, Peng J, Liu S Y, et al. Inhibitory effect of resveratrol derivative BTM-0512 on high glucose-induced cell senescence involves dimethylaminohydrolase/ asymmetric dimethylarginine pathway [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(5/6): 630-635.
[4] 吕春艳, 李 芳, 张兰桐. 天然产物中二苯乙烯类化合物的研究近况与开发前景[J]. 河北医科大学学报, 2009, 30(2): 213-216.
[5] Ioele G, Cione E, Risoli A, et al. Accelerated photostability study of tretinoin and isotretinoin in liposome formulations [J]. Int J Pharm, 2005, 293(1/2): 251-260.
[6] 韩文霞, 李伟泽, 汪兴军, 等. 盐酸青藤碱纳米柔性脂质体的制备及其性质研究[J]. ***, 2011, 42(4): 671-675.
[7] Lu Y, Li J, Wang G J. In vitroand in vivoevaluation of mPEG-PLA modified liposomesloaded glycyrrhetinic acid [J]. Int J Pharm, 2008, 356(1/2): 274-281.
[8] 琚 辉, 郝存江, 尹 飞, 等. 姜黄素固体脂质纳米粒的制备及表征[J]. **评价研究, 2010, 33(6): 420-426.
[9] Di Venosa G, Hermida L, Batlle A, et al. Characterisation of liposomes containing aminolevulinic acid and derived esters [J]. J Photochem Photobiol B, 2008, 92(1): 1-9.
[10] Bhatia A, Kumar R, Katare O P. Tamoxifen in topical liposomes: development,characterization and in vitroevaluation [J]. J Pharm Pharm Sci, 2004, 7(2): 252-259.
[11] 于燕燕, 赵继会, 冯年平, 等. 微柱离心-HPLC 法测定鬼臼**醇质体的包封率研究[J]. ***, 2010, 41(10): 1634-1637.
[12] Caddeo C, TeskačK, Sinico C, et al. Effect of resveratrol incorporated in liposomes on proliferation and UV-B protection of cells [J]. Int J Pharm, 2008, 363(1/2): 183-191.
[13] 李唐棣, 郝丽梅, 梅兴国, 等. 脂质体包封率的研究进展[J]. 国外医学: 药学分册, 2006, 33(3): 224-227.
[14] 王 健, 李明轩. 冷冻干燥对提高脂质体稳定性的研究概况[J]. 中国医药工业杂志, 2005, 36(9): 576-580
关键词:白藜芦醇**;薄膜分散法;微柱离心法;包封率;正交设计
白藜芦醇**(3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene,BTM)是白藜芦醇的全甲基化衍生物,具有明显的抗新血管生成、抗有丝分裂作用,可以引起微管分解和微管蛋白解聚,用于抗肿瘤**。此外,BTM具有抗过敏、保护胃粘膜损伤以及抗衰老作用[1-3]。但是BTM难溶于水,光照下易发生异构化并降解,使其应用受到限制[4]。脂质体可以增加难溶性的**的溶解性,提高光不稳定***的光稳定性[5-6]。本实验将BTM制备成脂质体,对其**工艺和质量特性进行评价,并考察脂质体对BTM的增溶作用。
1 仪器与材料
LC20A—DAD高效液相色谱仪(日本岛津),N—1100 旋转蒸发仪(东京理化器械公司), Digital sonifier S — 450D 超声波细胞粉碎机(美国 Branson Sonifier ) , Nano—ZS90激光散射粒径仪(英国Malvern公司),Sirion 200场发射扫描电镜(荷兰FEI公司)。BTM对照品(质量分数99.2%,中南大学化学化工学院提供),BTM样品(中南大学化学化工学院提供),卵磷脂(S100,德国Lipoid公司),胆固醇(天津博迪化工有限公司),葡聚糖凝胶G-50(北京瑞达恒辉科技发展有限公司),乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 BTM脂质体的制备
采用薄膜分散法[7-8]。精密称取适量磷脂、胆固醇、BTM于茄形瓶中,加入10 mL氯仿溶解后,旋转蒸发除去氯仿,使形成均匀透明的薄膜,加入5%甘露醇溶液15 mL,45 ℃水浴下水化4 h,使薄膜溶胀充分水合完全,得乳白色混悬液;探头超声2 min,0.45 μm微孔滤膜挤出,即得BTM脂质体。
2.2 BTM定量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(75∶25),柱温30 ℃,体积流量1.0 mL/min,检测波长318 nm,进样量20 μL。
2.2.2 专属性试验 分别取空白脂质体、BTM乙腈溶液、BTM脂质体各0.2 mL,甲醇破乳并稀释至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样测定。结果表明,在此色谱条件下,脂质体辅料对BTM定量测定无干扰。
2.2.3 线性关系考察 精密称取BTM对照品10.0 mg于50 mL量瓶中,加乙腈溶解稀释至刻度,得质量浓度为200.0 μg/mL的BTM储备液。精密量取上述储备液适量,乙腈稀释成质量浓度分别为0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL的系列溶液,按“2.2.1”色谱条件进样分析,以色谱峰峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归,得回归方程A=134 298.1 C-588.8,r=0.999 9,表明BTM在0.1~32.0 μg/mL线性关系良好。
2.2.4 精密度试验 分别配制质量浓度为1.0、8.0、32.0 μg/mL的BTM乙腈溶液各5份,按“2.2.1”色谱条件测定,计算日内精密度和日间精密度。日内精密度RSD分别为0.27%、0.43%、0.19%,日间精密度RSD分别为1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 稳定性试验 取BTM脂质体混悬液适量,加甲醇稀释至质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液,按“2.2.1”色谱条件,在0、2、4、6、8、12 h分别测定BTM的峰面积,计算其RSD分别为1.38%、1.06%、0.59%,表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.6 重复性试验 取BTM脂质体混悬液适量,加甲醇稀释至浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液,按“2.2.1”色谱条件,连续测定5次,其质量浓度基本无变化,RSD分别为0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率试验 精密吸取0.2 mL空白脂质体于5 mL量瓶中,分别加入25、200、400 μL质量浓度为200.0 μg/mL的BTM乙腈储备液,加入甲醇破乳并稀释至刻度,重复3次,得质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的样品溶液,分别进样测定,计算回收率。3种质量浓度的回收率分别为101.3%、99.3%、99.6%,RSD分别为0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱离心法[9-11]测定BTM脂质体的包封率
2.3.1 微型凝胶柱的制备 称取葡聚糖凝胶G-50 1.0 g于适量蒸馏水中,浸泡24 h,沸水浴煮沸20 min,使葡聚糖充分溶胀并除去气泡。静置冷却后,装填于2.5 mL注射器(底部填有适量脱脂棉)中,于离心机中3 000 r/min离心5 min,备用。
2.3.2 洗脱曲线的考察 精密吸取BTM脂质体混悬液0.2 mL,加于微柱的顶部,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;重复以上操作。从第12管开始更换洗脱液,用乙醇-水(3∶2)混合溶剂代替蒸馏水作为洗脱液,操作同上,继续收集10管洗脱液。所收集的洗脱液用甲醇破乳并稀释定容至5 mL。按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定A B C 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
BTM质量浓度,以洗脱管号为横坐标,BTM质量浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线,结果见图2。可知脂质体在前8管基本洗脱完全,BTM游离**则在第13管以后被缓慢洗脱,可见葡聚糖G-50微型凝胶柱可较好地分离脂质体与BTM游离**。该方法可用于BTM脂质体包封率的测定。
2.3.3 包封率的测定 精密量取BTM脂质体混悬液0.2 mL于微柱中,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水,2 000 r/min离心3 min,收集洗脱液;重复以上操作。合并1~8管洗脱液,甲醇稀释破乳后定容至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定BTM质量浓度,记为C脂;另取BTM脂质体混悬液0.2 mL,加入甲醇超声破乳,破乳后甲醇定容至5 mL,按“2.2.1”色谱条件进样分析,测定BTM质量浓度,记为C总,计算包封率。包封率=C脂/ C总C脂为包封于脂质体中的**质量浓度,C总为脂质体混悬液
中**的总质量浓度
2.4 单因素考察
2.4.1 药脂比对包封率的影响 固定胆固醇与磷脂的比为1∶3、水化介质为5%甘露醇、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取BTM与磷脂的质量比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制备脂质体,测定包封率分别为46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。结果表明,药脂比在1∶10以下时包封率可达70%以上。
2.4.2 膜材比对包封率的影响 固定药脂比为1∶20、水化介质为5%甘露醇、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取胆固醇与磷脂的比分别为1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制备脂质体,测定包封率分别为68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。结果表明脂质体的包封率随着胆固醇嵌入量的增加呈现先增加后减少的趋势。胆固醇对于脂质体起着膜流动性调节剂的作用,能适当提高**包封率和稳定性。但当胆固醇的量过大时,与脂溶***BTM竞争磷脂双分子层位置,导致包封率下降。
2.4.3 水化介质的种类对包封率的影响 固定胆固醇与磷脂的比为1∶3、药脂比为1∶20、水浴温度45 ℃、水化时间4 h,选取水化介质分别为5%甘露醇、0.01 mol/L PBS、蒸馏水制备脂质体,测定包封率分别为78.2%、69.4%、72.7%。结果表明,水化介质为5%甘露醇时,脂质体的包封率*佳。
2.5 正交设计优化**
在文献资料[12]及单因素考察试验基础上,以包封率为指标,选择**与磷脂质量比(A)、胆固醇与磷脂比(B)、水化介质的种类(C)为考察因素,每个因素各取3个水平,进行正交设计,选用L9(34) 正交表安排试验,制备脂质体,测定包封率。。由正交试验结果分析可知,影响脂质体包封率的因素顺序为C>A>B,*佳**为A3B2C1,即**与磷脂比为1∶20,胆固醇与磷脂比为1∶4,水化介质为5%甘露醇。
2.6 *佳**工艺的验证
按上述筛选得到的*佳**,制备3批BTM脂质体混悬液(约相当于BTM 0.33 mg/mL),测定包封率分别为88.7%、84.3%、86.2%。3次验证试验的结果基本一致,说明所确定的优化**合理可行,重现性良好。
2.7 BTM脂质体形态
取*佳**制备的BTM脂质体适量,用超纯水稀释100倍,以扫描电镜观察脂质体形态。可见脂质体形态圆整,多为球形及类球形粒子,大小较均一。
2.8 粒径和Zeta电位的测定取*佳**制备的BTM脂质体适量,适当稀释后,用激光散射粒径仪测定脂质体的平均粒径和Zeta电位。脂质体的平均粒径为(183.6±2.1)nm,PDI为0.265±0.006,Zeta电位为(−15.3±1.2)mV。
2.9 初步稳定性考察
取*佳**制备的BTM脂质体3批,置于(4±1)℃冰箱中,于3、5、10 d取样,分别考察外观、粒径、Zeta电位和包封率的变化。结果BTM脂质体在4 ℃条件下放置10 d后,外观没有发生明可以看出,低温放置10 d,脂质体的外观、粒径及Zeta电位没有发生明显的变化,包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取过量的BTM原料药置于具塞试管中,加入超纯水,涡旋使分散均匀,于(25±1)℃的恒温振荡器中48 h,平衡后取样,用0.45 μm微孔滤膜过滤,按“2.2.1”下色谱条件进样分析,测得BTM在纯水中的饱和溶解度为0.32 μg/mL。取适量BTM脂质体于西林瓶中,加入10%蔗糖溶液作为冻干保护剂,冷冻干燥,得到冻干脂质体。取过量冻干粉于纯化水中,振摇复溶使分散均匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,加入甲醇破乳后,按“2.2.1”下色谱条件进样分析,测得BTM脂质体中**的饱和溶解度为324.2 μg/mL。BTM脂质体较其原料药在水中的饱和溶解度提高了1 012多倍,表明脂质体对BTM有较好的增溶作用。
3 讨论
BTM难溶于水,为脂溶***。薄膜分散法简单易行,适合于脂溶***脂质体的制备。本实验采用该法制备BTM脂质体,通过正交实验筛选*佳组成。制备过程中,成膜和水化是影响脂质体包0.1 1 10 100 1 000 粒径/ nm −200 −100 0 100 200Zeta电位/ mV 封率与粒径的关键步骤。成膜太厚、水化不完全,制得的脂质体粒径偏大,放置易聚集,影响脂质体的稳定性;成膜不均匀,导致**未能很好地嵌入脂质体双分子层中,影响脂质体的包封率。脂质体包封率的测定方法通常有凝胶柱层析法、透析法、超速离心法、微柱离心法等[9-11,13]。凝胶柱层析法消耗时间长,且不易控制洗脱液的体积流量;透析法消耗时间也较长;超速离心法要求较高离心力才能将脂质体和游离**分离。微柱离心法是一种快速、简便地分离脂质体中游离**的方法,其优点是脂质体混悬液几乎没有被稀释,可以避免脂质体的渗漏。本实验采用微柱离心法测定BTM脂质体的包封率,脂质体与游离**分离效果好,方法简便,重复性好。采用*佳**制备的3批脂质体,包封率较高,粒径分布均匀,重现性良好,并且可以显著提高BTM的溶解度���放置10 d后,外观和粒径均未发生明显的变化,但包封率略有降低,推测**可能出现渗漏。将脂质体冻干,可以显著降低磷脂的水解和氧化速率,提高脂质体的稳定性[14],实验拟进一步考察BTM冻干脂质体贮存稳定性。
参考文献
[1] Pan M H, Gao J H, Lai C S, et al. Antitumor activity of 3, 5, 4′-trimethoxystilbene in COLO 205 cells and xenografts in SCID mice [J]. Mol Carcinog, 2008, 47(3): 184-196.
[2] Li L, Luo X J, Liu Y Z, et al. The role of the DDAH-ADMA pathway in the protective effect of resveratrol analog BTM-0512 on gastric mucosal injury [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2010, 88(5): 562-567.
[3] Yuan Q, Peng J, Liu S Y, et al. Inhibitory effect of resveratrol derivative BTM-0512 on high glucose-induced cell senescence involves dimethylaminohydrolase/ asymmetric dimethylarginine pathway [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(5/6): 630-635.
[4] 吕春艳, 李 芳, 张兰桐. 天然产物中二苯乙烯类化合物的研究近况与开发前景[J]. 河北医科大学学报, 2009, 30(2): 213-216.
[5] Ioele G, Cione E, Risoli A, et al. Accelerated photostability study of tretinoin and isotretinoin in liposome formulations [J]. Int J Pharm, 2005, 293(1/2): 251-260.
[6] 韩文霞, 李伟泽, 汪兴军, 等. 盐酸青藤碱纳米柔性脂质体的制备及其性质研究[J]. ***, 2011, 42(4): 671-675.
[7] Lu Y, Li J, Wang G J. In vitroand in vivoevaluation of mPEG-PLA modified liposomesloaded glycyrrhetinic acid [J]. Int J Pharm, 2008, 356(1/2): 274-281.
[8] 琚 辉, 郝存江, 尹 飞, 等. 姜黄素固体脂质纳米粒的制备及表征[J]. **评价研究, 2010, 33(6): 420-426.
[9] Di Venosa G, Hermida L, Batlle A, et al. Characterisation of liposomes containing aminolevulinic acid and derived esters [J]. J Photochem Photobiol B, 2008, 92(1): 1-9.
[10] Bhatia A, Kumar R, Katare O P. Tamoxifen in topical liposomes: development,characterization and in vitroevaluation [J]. J Pharm Pharm Sci, 2004, 7(2): 252-259.
[11] 于燕燕, 赵继会, 冯年平, 等. 微柱离心-HPLC 法测定鬼臼**醇质体的包封率研究[J]. ***, 2010, 41(10): 1634-1637.
[12] Caddeo C, TeskačK, Sinico C, et al. Effect of resveratrol incorporated in liposomes on proliferation and UV-B protection of cells [J]. Int J Pharm, 2008, 363(1/2): 183-191.
[13] 李唐棣, 郝丽梅, 梅兴国, 等. 脂质体包封率的研究进展[J]. 国外医学: 药学分册, 2006, 33(3): 224-227.
[14] 王 健, 李明轩. 冷冻干燥对提高脂质体稳定性的研究概况[J]. 中国医药工业杂志, 2005, 36(9): 576-580
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