【上海欣软整理】捕食应激致大鼠的持续性情绪唤醒障碍

摘要

目的：探讨严重心理应激是否可引发实验大鼠较长时间的情绪唤醒水平障碍，以建立较理想的创伤后应激障碍动物模型。

方法：实验于2004- 01 /2005- 06 在解放军成都**成都总医院完成。选择雄性Wistar 大鼠135只, 成组设计随机分为捕食应激组75 只和正常对照组60 只。先将大鼠放入捕食应激实验箱的小笼中，再将一只饥饿的猫放入实验箱中，使猫与大鼠无生理伤害性接触，致大鼠出现轻微惊恐性颤动及因惊吓所致呼吸急促而快速鼻翼煽动6～8 min；正常对照组大鼠除不接触猫外，其他处理程序相同。并通过大鼠运动活性、探究行为、拒俘反应性和高架十字迷宫实验观测应激后4个月内实验大鼠情绪唤醒水平改变，同时以Morris 水迷宫法检测其空间学习和记忆能力。采用SPSS 9.0 软件进行单因素或双因素方差分析，以及各组均数的SN-K法和Tamhane’s T2 法检验。

结果：参与实验大鼠135只在实验过程中无死亡，均进入结果分析。①与正常对照组相比，捕食应激后1个月内应激大鼠旷场爬越行为明显减少[（71.5±13.5），（96.8±18.4）分，P < 0.05]；4 个月时后肢性站立仍明显减少[（11.4±2.1），（17.9±3.3）分，P < 0.05]。②与正常对照组相比，高架十字迷宫实验中应激大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均明显降低[(4.8±0.9)%，(20.7±3.7)%，P < 0.01]；[(0.9±0.2)%，(6.6±1.2)%，P < 0.01]。③与正常对照组相比，拒俘反应性则在应激后2 个月内明显增加[（2.4±0.5），（1.5±0.4）分，P < 0.05]。④与正常对照组相比，捕食应激后第1 天应激大鼠在Morris 水迷宫空间觅向训练中潜伏期明显延长训练15 次时为(32±6)，(17±3) s，P < 0.05]，在空间定向能力测试时应激大鼠水迷宫的4个象限中无目的漫游所花费时间百分比差异无显著性意义。应激后2 周时大鼠空间学习和记忆能力测试无明显改变。

结论:单纯捕食应激成功诱发了实验大鼠持续性运动活性减少、探究行为受抑、警觉水平过高、焦虑不安状态、环境适应能力下降、惊恐逃避反应等多种情绪唤醒障碍，以及短期空间学习和记忆等认知能力受损表现，具有与创伤后应激障碍相似的致病因素与过程，可基本模拟其主要临床表现。

主题词：应激障碍，创伤后；捕食应激；情绪唤醒；动物模型

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。

单位：解放军成都**成都总医院神经内科。

材料：实验于2004- 01 /2005- 06 在解放军成都**成都总医院完成。选择雄性Wistar 大鼠135 只，实验起始体质量（185±9）g，由解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供(许可证号：scxk-（军）2002008)。12 h 光亮/黑暗条件、22～25 ℃ 环

境温度，分隔喂养。成组设计随机数字表法分为捕食应激组75 只及正常对照组60 只。

仪器：按文献自制捕食应激实验箱（1 m×1 m×1 m 铁丝笼，中间放置20 cm×15 cm×15 cm 小铁丝笼，便于实验时将大鼠放入其中）。按文献[5, 6]自制旷场行为观察箱(60 cm×60 cm×60 cm 的无顶木盒，箱底用墨线分为36 个等份小方格。用于大鼠情绪唤醒水平检测)。按文献[7]制备高架十字迷宫(木质结构，包括2 个50 cm×10 cm 的相对开臂和2 个50 cm×10 cm ×40 cm的相对闭臂，闭臂的上部是敞开的。迷宫中央有10 cm×10 cm的开阔部。迷宫离地面50 cm。用于评价大鼠焦虑样行为改变)。按文献[8]制备Morris水迷宫(直径1.2 m、高0.5 m 的圆桶，划为4 个象限（按顺时针方向定义为A、B、C、D），盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成为不透明的乳白色，水温控制于22～25 ℃。将直径11 cm平台固定于某一象限（本实验中置于A 象限），平台在水平面下1 cm。用于空间学习和记忆能力观察)。

设计、实施、评估者：设计为**作者，资料收集为**、二、三作者，实施为**、二、三、四作者，评估为**、五作者。实验实施前所有参与者均经过相关专业统一培训。

方法：

模型制备：先将大鼠放入捕食应激实验箱的小笼中，再将1只饥饿的猫放入实验箱中，使猫与大鼠无生理伤害性接触，致大鼠出现轻微惊恐性颤动及因惊吓所致呼吸急促而快速鼻翼煽动6～8 min，以确保实验大鼠相似的应激强度及稳定的应激效应。正常对照组大鼠除不接触猫外，其他处理程序相同。

情感行为观察：于捕食应激后1，14 d，1，2 和4 个月时分别取正常对照组及捕食应激组大鼠各12、15只，观察其情感行为改变：①大鼠运动活性：将大鼠轻轻放入旷场行为观察箱中央小方格内，观测5 min 内动物的活动情况。计分标准：大鼠1 /2 以上身体从所在方格进入相邻方格，即爬越1 次计1 分，所得总分用于评价其运动活性改变。②探究行为：方法同上，观察5 min内大鼠后肢性站立计分改变。计分标准：后肢性站立1次计1分，总分用于评价其探究行为改变。③拒俘反应性：以动物从未接触过的手套轻抓大鼠，观察其反应。记分标准：0 很容易抓取动物；1 尖叫或回避；2 尖叫并回避；3 逃脱；4 逃脱并尖叫；5 咬或试图撕咬手套；6主动跃起攻击；以此评价动物恐惧与冲突素质特征改变[6]。④高架十字迷宫实验：将大鼠置于迷宫中央，头朝闭臂。分别记录5 min 内大鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间（以四肢全部入臂或出臂为准），计算大鼠进入开臂的次数和在开臂滞留时间分别占总次数(进入开臂与闭臂次数之和）及总时间（在开臂与闭臂滞留时间之和）的百分比，以此为评价焦虑指标。

空间学习和记忆能力观察:采用Morris 水迷宫法[8]，观察捕食应激后第1 天，2 周时空间学习和记忆能力的改变。第1，2 天为空间觅向训练：第1 天训练9 次，2 min /次，记录大鼠从不同象限入水至发现并爬上平台的时间为训练潜伏期，每3 次的均值作为平均训练潜伏期；第2 天重复进行6 次训练；比较所得的5 个平均训练潜伏期变化以分析动物获取空间信息的能力。第3 天进行空间定向能力测试：先将平台移去，再将大鼠放入水中2 min，记录它在四个象限中停留时间的百分比，以判断动物记忆储存及提取再现能力。

主要观察指标：大鼠爬越行为、后肢性站立、拒俘反应性、高架十字迷宫开臂次数与开臂时间、Morris 水迷宫平均训练潜伏期及不同象限停留时间百分比。

统计学分析：由成都**成都总医院信息科统计室采用SPSS 9.0 软件进行单因素或双因素方差分析，以及各组均数的S- N- K法（用于方差齐性的大鼠爬越行为、拒俘反应及开臂次数百分比的比较）和Tamhane’sT2法检验（用于方差不齐性的大鼠后肢性站立、开臂时间百分比及空间学习和记忆能力改变的比较）。

2 结果

2.1 实验动物数量分析参与实验大鼠135只在实验过程中无死亡，均进入结果分析。

2.2 大鼠捕食应激后不同时间情感行为观察结果

2.2.1 大鼠捕食应激后不同时间旷场行为改变和高架十字迷宫行为改变结果。

表1 显示，捕食应激大鼠应激后1个月内旷场爬越行为明显减少，显示其运动活性降低，之后渐恢复正常；而4个月时后肢性站立仍显著减少，表明其探究行为明显降低。捕食应激后4 个月内，应激大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均明显降低，并于应激后1 个月时稍有恢复，但2个月后则进一步降低。

2.2.2 大鼠捕食应激后不同时间拒俘反应性结果见表2。大鼠拒俘反应性在应激后2个月内明显增强。

3 讨论【上海欣软整理】捕食应激致大鼠的持续性情绪唤醒障碍

创伤后应激障碍临床表现多样，包括反复重现创伤性体验症状，情感麻木与回避症状，警觉过强所致持续性焦虑、惊恐逃避反应及易激惹症状等症候群。作者的前期工作分别建立了海马惊厥阈下电刺激和大鼠加强捕食应激两种创伤后应激障碍动物模型。虽然二者均可诱发实验大鼠造型后1个月内创伤后应激障碍样行为异常，但由于前者很难排除电刺激等影响因素的作用，且与创伤后应急障碍的致病因素亦有较大差异；而后者采用了捕食应激与再次环境刺激相结合的方法，很难排除2次应激效应的影响；同时，两种模型观察时间有限，且所用行为学研究方法的定量、定性分析不足，难以排除研究者主观因素的影响；因此，有必要进一步改进应激模式、控制应激强度，以诱发实验大鼠更长时程的应激相关情感行为异常，并定量分析相关情绪唤醒障碍的性质。

鉴于应激因素与强度，以及受害者当时的极度无助感在创伤后应激障碍发病中有重要意义，利用动物食物链中特殊的捕食行为，模拟与之相似的致病因素和过程。同时，通过反复试验发现，捕食应激4～9 min即可引发大鼠出现轻微惊恐性颤动，以及因惊吓所致呼吸急促而快速鼻翼煽动，而持续这种惊吓状态6～8 min（即总体应激时间在11～17 min）时，可确保实验大鼠基本相似的应激强度及稳定的应激效应；更有趣的是，此时的应激效应亦可能*佳，并由此引发了实验大鼠在4 个月的观察时间内存在明显的情感行为障碍；而应激不足或过强、持续时间过短或过长，似均难以达到类似的效应，但应激方式和强度与应激相关情感行为异常间的关系尚不能确定，有待进一步探讨。

旷场行为观察是检测实验动物情绪唤醒水平的一种重要方法。动物初入陌生环境可出现明显的防护性情感反应，这对于量化分析实验动物的警觉水平、焦灼状态、环境适应能力等有重要意义。实验结果显示，捕食应激大鼠应激后1个月内旷场爬越行为明显减少，提示其新环境中运动活性显著降低；拒俘反应性则在应激后2个月内显著增强，显示其受惊吓程度严重、冲突特性增强、易激惹、挣扎行为明显；而4个月时后肢性站立仍显著减少，表明其挫折感明显、探究行为显著受抑。由实验结果可见，捕食应激可致实验大鼠在新环境中的警觉水平明显增高、易激惹、适应能力显著下降，在应激刺激后较长时间内一直处于惊恐逃避情感反应中。

高架十字迷宫试验则是利用动物对新异环境的探究特性，以及对高悬敞开臂的恐惧感而形成的矛盾冲突状态来评价实验动物焦虑素质特征的。实验结果显示，捕食应激后4个月内，应激大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均明显降低，提示捕食应激对大鼠有明显的长时间的致焦虑效应；有趣的是，实验大鼠焦虑情绪于应激后2 周内进行性加重，1个月时有所缓解，但2个月后则再次进一步加重，显示严重心理应激所致实验大鼠情绪唤醒障碍可能主要以焦虑相关行为为特征，与创伤后应激障碍患者极为相似，具体原因尚待进一步探讨。

Morris 水迷宫是一种研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型，能较准确地反映动物的空间学习和记忆能力。在Morris 水迷宫的空间觅向训练期，捕食应激后1 d 应激大鼠较正常对照组花费更多的时间以找寻平台，显示其学习和记忆的获得与巩固过程受到影响；而在空间定向能力测试期，应激大鼠空间定向能力亦明显受损，显示捕食应激可导致实验动物记忆过程的不稳定性，且对己储存记忆的读出或提取过程可能也有一定影响。而实验后2周时两组动物的空间学习和记忆能力并无明显差异，提示严重心理应激只引发了实验动物短期的学习和记忆能力受损，与创伤后应激障碍患者存在的短暂认知功能受损颇

为相似。