新物体识别实验与Morris水迷宫实验比较

【摘要】目的应用物体识别方法研究D2半乳糖长期注射致脑老化小鼠模型的学习记忆能力,并比较物体识别方法与Morris 水迷宫方法对该模型测试的灵敏性。方法C57BL/ 6 小鼠,随机分成正常对照组、D2半乳糖低剂量组(50mg/ kg ,sc) 、D2半乳糖高剂量组(100mg/ kg ,sc) ,连续造模8 周。以物体识别方法和Morris 水迷宫方法测试各组动物的学习记忆能力。结果在物体识别测试中, D2半乳糖高剂量组分辨指数(15. 71 ±3. 94) 较对照组(45. 89 ±7. 41) 减低具有非常显著性意义( P < 0. 001) ,低剂量分辨指数(24. 69 ±6. 25) 与对照组的差异也存在显著性意义( P < 0. 05) 。在Morris 水迷宫测试中,D2半乳糖高剂量组动物逃逸潜伏期比对照组延长有显著性意义( P < 0. 01) ;高剂量组在目标象限空间探索所停留时间与游泳距离比均较正常对照组减少有显著性意义( P < 0. 05) 。结论D2半乳糖可导致小鼠出现显著的物体识别能力障碍,用物体识别测试方法比Morris 水迷宫方法更灵敏地反映该模型小鼠的学习记忆障碍。

【关键词】D2半乳糖; 学习记忆; 物体识别; 水迷宫; 脑老化

一、实验概述

物体识别测试(Object Recognition Test) 是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法。该方法具有让鼠在自由活动状态下进行学习记忆测试的特点,能更近似地模拟人类的学习记忆行为。本研究拟应用物体识别方法研究D2半乳糖长期注射致脑老化小鼠模型的学习记忆能力,并与水迷宫行为学测试相比较,为促进物体识别测试方法在我

国学术界的应用提供借鉴材料。

因C57BL/ 6 近交系小鼠已被证明有良好物体识别与空间记忆能力, 以及随衰老而记忆力减退规律,本实验选用C57BL/ 6 小鼠,3 月龄,雌性,体质量(20 ±2) g ,购于北京大学医学部动物中心(许可证号:SCXK(京) 200220001) ,适应性饲养一周后,随机分成正常对照组、D2半乳糖低剂量组、D2半乳糖高剂量组。小鼠均在无特殊致病原(SPF) 级动物室饲养至行为学测试前。低剂量组每日于背部皮下注射D2半乳糖(购自Sigma 公司, G5388) 50mg/ kg ,高剂量组每日皮下注射D2半乳糖100mg/ kg ,对照组注射等量生理盐水,连续8 周。

二、行为学测试

1. 物体识别试验: 造模8 周后, 参考Ennaceur等方法进行物体识别试验,装置主要由一个测试盒(自制) 与2 套(每套2 只) 测试物体组成,测试物体在实验前经筛选有近似的小鼠喜好程度。本实验测试盒以45cm ×35cm ×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。（备注：物体识别实验系统可以选购上海欣软公司研发的SuperMaze软件，型号为XR-XX117），物体A 套为蓝色方形硬塑儿童玩具,约4. 5cm ×4. 5cm ×5 cm ,B 为白色圆柱形塑料盒,底面直径4cm ,高7cm ,两物体均足够重以防止小鼠推动。测试环境要求在隔音、避光的场所。在测试盒上方以60W 白光灯照射使盒内无阴影处。

测试主要分适应期、熟悉期和识别期：

第1 天为适应期:在上述条件下,将鼠放入测试盒的中间,盒内未放任何物体,让其自行适应性活动10min。

第2 天为熟悉期: 在测试盒中放入2 个相同的玩具(AA 或BB) ,距离长轴(45cm) 两侧壁8cm ,将鼠从盒中距物体等距离处放入。测试者两手各握1 只秒表(上海秒表厂) ,每只秒表对着1 个动物,开始纪录其在每个物体上的探索时间(以鼠嘴凑近物体约2cm 范围内计时,鼠爬在玩具上玩或者只是在物体附近走则能计入) ,以秒表间断累积计时测定鼠探索每个物体的时间总和,为在第3 天的计时提供练习。

第3 天为识别测试期:将另外一套中的一个物体替换前**中的一个玩具放入盒内(AB 或BA) ,将鼠放在盒中距两物体等距离处10min。每只鼠测试完成后,用酒精擦拭物体以消除鼠停留在物体上的气味,并且按次序轮流调换各物体在盒内的位置,以消除鼠对物体在盒内位置喜好程度不同而带来的影响。为进一步减少两种物体本身差异对鼠探索时间比较的影响,本实验以两位测试者在同一实验室内用两个相同装置测试每组的一半动物,但两装置中的物体

相对应鼠的新旧次序相反(如A 在一测试者为新物体在另一测试者则为旧物体) 。鼠的物体识别能力以第3 天探索新旧物体的时间,并以探索时间计算分辨指数(discrimination index ,DI) 来评价。分辨指数计算公式为:DI = (N-F) / (N + F) ×100 % ,式中N 为在探索新物体所用的时间,F 为探索旧物体所用的时间。

2. Morris 水迷宫:由4d 的训练期和第5天的空间探索试验组成,见参考文献。

三、统计方法

各组动物在物体识别试验的新旧物体探索时间、分辨指数和在水迷宫空间探索中在目标象限所停留时间与距离比以单因素方差分析结合Post Hoc2Duncan法进行组间比较分析;4d Morris 水迷宫中的逃逸潜伏期(从入水到找到站台的时间) 以重复测量的双因素方差分析进行比较分析。数据以x ±s 表示。

四、讨论

D2半乳糖长期皮下注射可导致小鼠出现显著的物体识别记忆能力障碍。而且用物体识别测试方法比Morris 水迷宫方法更灵敏地反映该模型小鼠的学习记忆障碍。鼠的物体识别能力与海马、基底前脑和嗅周皮层等脑区功能有关,受自由基损伤以及脑内单胺递质含量等因素影响。Morris水迷宫测试的空间学习记忆能力与海马、纹状体、基底前脑、小脑等脑功能区域有关。D半乳糖可造成鼠脑皮层与海马自由基损伤、脑内单胺递质含量减少,可能是导致其物体识别以及空间学习记忆能力减低的原因。

Luparini 等发现在物体识别测试中出现的老年鼠轻度记忆损害现象在Morris 水迷宫测试中消失,与我们的研究结果类似。造成这两种学习记忆测试方法敏感性不同的可能原因有二: ①鼠的精神状态。在物体识别测试中,鼠始终处于自主活动的状态,是在日常精神稳定状态下进行的测试;而在水迷宫中,鼠去找平台是在害怕沉水的应激下进行,应激本身可导致学

习记忆能力下降。②两种行为测试方法所依赖的脑功能区域不同。近年来的研究证据表明,物体识别与嗅皮质或嗅周皮质有高度相关,如细胞毒性造成大鼠的嗅皮质损伤只造成物体识别能力损害而空间记忆保持 ,而空间学习记忆能力似乎比物体识别记忆更依赖于海马功能,如海马CA3 区域的部分损伤以及后海马的神经毒性损伤可导致Morris 水迷宫空间识别障碍而无物体识别能力的损伤表现,D2半乳糖致脑老化鼠在嗅周皮质的损伤是否比在海马区损伤严重值得进一步研究。

我们应用物体识别测试方法的体会主要有: ①在测试盒内光线要充足,不能留有阴暗处或裂缝; ②测试物体在要实验前作鼠喜好性筛选,并且足够大以引起鼠的注意; ③测试者在测试第2 天需训练秒表间断连续计时法以使第3 天能熟练计时; ④测试过程中更换两物体在测试盒内的位置,并只在鼠探索物体时才计时; ⑤该法测试时间相对长,在需测动物数较多时可以两人同时进行。总之,物体识别测试方法简便、灵敏,适合学习记忆功能障碍的机理及**学研究。新物体识别实验与Morris水迷宫实验比较