前面的技术文章中,我们曾提到过,细胞培养过程中的化学污染和生物污染,现介绍几种**和预防的方法:一、污染的** 培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底**操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法**。(一)使用*** ***对杀灭**较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双***(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL),污染后**用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用***品种除青霉素、链霉素外,还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理,每隔2~3日换液1次,传1~2代进行**。近年来有报道,4-氟,2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种***单用或合用对杀灭支原体有效。这三种***均用PBS配成250X浓缩液,-20℃保存备用,使用浓度Cip为10μg/mL,BM-1为10μg/mL,BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液,加入含BM-1的RPMI1640培养液,3天后再吸除培养液,加入含BM-2的RPMI1640培养液,培养4天,如此连续3个轮次,直至用33258荧光染色镜检证明已**支原体后,再加正常培养液培养传代3-4次。(二)加温处理 将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有**影响。所以在处理前要进行预试验,摸索能*大限度杀死支原体又对细胞影响*小的加热时间。此法有时不可靠。若先用**处理后,再以41℃加温处理效果更佳。 (三)使用支原体特异性血清用5%的兔支原体**血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦,不如用***方便、经济。 (四)其他方法 除了上述去除污染的方法外,还有动物体内接种**法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等,但均较麻烦,且效果不确定。所以一旦支原体污染,除非有特别重要价值,一般均弃之重新培养。二、污染的预防 预防是防止细胞培养过程中发生污染的*好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到*小程度。一般预防可从以下几方面着手:(一)从物品、用品****着手 细胞培养所用物品清洗、**要彻底,各种溶液****要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁****。(二)从操作者做起 1、操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经**的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。2、操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。3、操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,*后用**水浸泡的纱布擦台面。(三)防止细胞交叉污染 在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,*好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。 所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。