显微镜相关知识

用于显微注射用的显微镜常使用具有相差(phasecontrast) 与微分干涉(differential interference contrast) 功能的倒置显微镜( 例如奥林巴斯的倒置显微镜IX 系列) 。

倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，一般正置显微镜的物镜在载物台之上，照明系统在下，而倒立式显微镜为物镜在下，照明系统在载物台之上。倒置显微镜的优点为物镜与目镜间的工作距离较长，可直接将培养皿置于显微镜操作台上进行显微注射等工作。

传统的普通光学显微镜无法直接观察未经染色的透明活细胞，为了能让显微注射技术观察与操作透明的活细胞样品，显微镜必须使用具有相差与微分干涉功能的倒置显微镜。

相差显微镜是由P.Zernike 于1932 年发明的，并因此获得1953 年诺贝尔物理奖。这种显微镜*大的特点是可以观察未经染色的透明标本和活细胞。相差显微镜的基本原理是利用透明细胞检体内部折射率的各不相同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，得到明暗对比的效果，使得透明活细胞各种结构内部细节在亮背景视野中变得清晰可见。

相差显微镜的基本构造是利用相差聚光镜及内部相环所构成的环状光圈，当光通过聚光镜后，产生中空光锥，并在光线穿过检体后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ （波长），如果再经过物镜内的光延迟位环板而成增加或减少1/4λ ，则光程差变为1/2λ ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小提高反差。

虽然相差显微镜可以为透明的细胞样品提供清晰的观察图像，但是一般相差显微镜的缺点是会有“光晕”现象产生。因而导致观察的景深受限制，无法用来观察较厚的样品。较厚的细胞团区域在一般相差显微镜下的清晰度十分糟糕，而且边缘常产生晕轮效果，如果观察样品中有超过 85% 以上的区域为较厚细胞时，这个问题将非常严重。然而显微注射的样品如受精卵细胞或细胞团均具有一定厚度，造成细胞结构和边缘无法清楚可见，因此显微注射用的显微镜必须要能克服厚样品的问题。

为解决活动样品和厚样品带有“光晕”的观察问题，1952 年，Nomarski 在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope ）。Nomarski 微分干涉差显微镜的优点是能显示结构的三维立体投影影像。与传统相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。

微分干涉差显微镜技术设计比相差显微镜要复杂得多，Nomarski DIC 利用的是偏振光，具有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer ）、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器（analyzer ）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了二个楔形单轴的晶体 , 如石英, 以光轴互相交错的方式互相接合，称为Wollaston 棱镜或Nomarski 棱镜，即DIC 棱镜。此棱镜可将每一光线分离成为二条偏振互相垂直的两束光（x 和y ），二者成一小夹角，聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。*初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了**个 Wollaston 棱镜，即DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束，这时两束光的偏振面（x 和y ）仍然存在。*后光束穿过**个偏振装置，即检偏器，在光束形成目镜DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。 x 和y 波的光程差决定着透光的多少，当光程差值为0 时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到*大值，于是在灰色的背景上，标本结构便呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到*佳状态，观察者可通过调节 DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，改变光程差可以改变影像的亮度。而调节DIC 滑行器则可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，产生了类似大理石上的浮雕感觉。 DIC 显微镜使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常需要在这种显微镜下进行。

  虽然 Nomarski 微分干涉技术可以对付一些细胞团或者组织等较厚的样品，但它非常昂贵，并且仅仅只能应用在玻璃底的培养皿中，无法直接在广为研究人员进行细胞培养操作的一般塑料材质的培养皿产生浮雕效果，此外这种技术对于显微操作技术的所使用的样品而言，景深还是稍嫌不足，因此在应用上遇到不少问题。有鉴于此，一些其它的可以用于观察厚样品的微分干涉技术也逐渐被开发出来。例如 OLYMPUS 奥林巴斯公司就推出了自己的浮雕相衬（ RC ）装置奥林巴斯浮雕相衬系统能够产生高反差的 3D 图像，类似于 DIC 效果，可用于塑料器皿中的样品。浮雕相衬用于细胞受精，使细胞核膜更容易看到和穿刺。适用于所有类型的细胞 , 组织 ( 无论活体 , 染色 , 未染色 ), 晶体表面细节 , 透明聚合物 , 玻璃和其它类似材料 , 尤其适应于显微操作实验。