大鼠胃蛋白酶(Pepsin)ELISA试剂盒

 (用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 Pepsin 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 Pepsin与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠Pepsin，形成**复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，*后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，Pepsin浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Pepsin浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

准备试剂与收集血样

1.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

2.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆至少作1：10稀释。

3.标准品液配制：取8个1.5ml离心管，**管加标本稀释液900ul，**至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul，移至**管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔加入蒸馏水和**抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。

2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值计算出相应Pepsin含量，再乘上稀释倍数即可。软件可以向本公司邮件索取。

试剂盒性能

        1.灵敏度：*小的Pepsin 检测浓度小于16pg/ml。

2.特异性：可同时检测重组或天然的大鼠Pepsin。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。

3.重复性：板内、板间变异系数均小于10％。

注意事项

         1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

   2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致**度误差及OD值错误地升高。

         3.检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

         4.试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

         5.说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！

   6.本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！