中药肾康注射液由黄芪、丹参等4味中药制成,是用于**慢性肾衰的一种新药,给**式为静脉滴注,制剂稳定,无毒副作用,疗效显著**。有文献报道用TLC法[1,2]或液相色谱[3~5]法测定丹参中原儿茶醛含量。本文采用TLC法作为样品前处理的纯化手段,以HPLC法测定丹参制剂肾康注射液中原儿茶醛含量,本法准确、灵敏、重现性好。1 药品与试剂原儿茶醛对照品由中国药品生物制品检定所提供;肾康注射液由成都市中医药研究所制剂研究室研制,批号:910314、920815、931014,规格:每瓶100 mL;实验用水为双重蒸馏水;其余试剂均为分析纯。2 仪器与色谱条件STI5000液相色谱仪,紫外检测器,。分析柱:Shi度冷丁(哌替啶)是临床上广泛使用的一种麻醉止痛药,一般用于术前**和术后镇痛作用。其分析方法多为GC法[1~4],HPLC测定法国内外报道得很少。本文通过寻找适宜的色谱条件,建立了快速、灵敏、高选择性的HPLC法测定全血中度冷丁的含量并应用于临床病人的测定。病人手术中合用的其它**不干扰测定,结果满意。1 仪器 STI5000高效液相色谱仪,UV5000检测器,N2000工作站。2 试药与试剂 度冷丁对照品(公安部**研究所购得);乙腈:色谱纯;水:二次重蒸水;甲醇:分析纯甲醇重蒸;正己烷:分析纯正己烷经浓硫酸处理后重蒸。其它试剂均为分析纯。磷酸盐缓冲液的配制:称取磷酸氢二钾2.6 g于1 L水中,用0.9 mol.L-1的磷酸调至pH=7,并通过0.45μm微孔滤膜过滤。3 色谱条件 色谱柱:Spherisorb CN(10 μm,4.0 mm×250 mm)柱及CN预处理柱(4.0 mm×20mm),大连依利特公司;流动相:乙腈-15 m mol.L-1磷酸盐缓冲液-甲醇(62∶25∶13);流速:1.0mL.min-1;检测波长:205 nm。4 样品处理 准确吸取血样1 mL于10 mL具塞离心试管中,肝素抗凝,加入无水乙醇0.5 mL,1 mol.L-1氢氧化钠(pH=11)100μL,摇匀。正己烷6 mL萃取2次,每次涡旋振荡6 min,然后离心(3500 r.min-1)2 min,合并正己烷层于10mL离心管中,70 ℃水浴蒸干。临近蒸干时,用正己烷洗涤管壁2次,每次0.5 mL,使待测物质集中于试管底部。残渣用50μL流动相溶解,吸取20 μL进样测定。空白血样、加样血样及临床病人血样的提取色谱图见图1。图1 度冷丁分离色谱图A.空白血样 B.加样血样 C.临床病人血样1.度冷丁(8.57 min) 2.杂峰5 线性关系与检测限 精密称取度冷丁对照品适量,用1 m mol.L-1 磷酸配成1 mg.mL-1的度冷丁储备液,再稀释成0.04mg.mL-1的工作液。精密吸取不同量的度冷丁工作液分别加到1 mL正常人血中配成系列标准溶液50、100、260、500、1000ng.mL-1。按样品处理项下处理,进样20 μL测定,以峰高(A)对浓度(C)回归,求得线性回归方程:C=0.06A+11.8 r=0.9998 n=5当S/N=2时,检测限为25 ng.mL-1。线性范围为50~1000 ng.mL-1。6 回收率及精密度 取正常人血1 mL分别加入适量的度冷丁工作液配成不同血药浓度的溶液数份,同法处理测定,连续测定7d,每个浓度平行测定5次,7 临床应用用本法测定9例手术病人(静脉或肌肉注射50 mg度冷丁)血药浓度病人血样测定结果(n=3)
本篇文章来源于 HPLC法测血液中度冷丁的含量|科学仪器在线 原文链接:http://www.hg17.com/knowledgeview525.htmlpackODS柱 ( 5 μm, 6 mm×150 mm );预柱:YWG-C18柱(7 μm , 4.6 mm×150 mm);流动相:甲醇-水-冰醋酸 (24∶75∶1);流速:1.0 mL.min-1;柱温:30 ℃;检测波长:328 nm。3 直线回归方程的测定取原儿茶醛对照品,加甲醇溶解并稀释成1 mg*mL-1的对照品贮备液,放冰箱4℃保存备用;精密量取该贮备液适量,用甲醇配成含原儿茶醛分别为20、40、60、70、80及120μg.mL-1的对照品溶液,各进样10μL,按色谱条件测定。以原儿茶醛基线构成之面积称峰面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064 Wh/2h>峰面积( Y)对对照品溶液浓度( X )回归得直线方程:Y=177029+70651X r=0.9996结果表明:原儿茶醛检测限为0.9 μg.mL-1 (S/N = 3∶1),线性范围为20~120 μg.mL-1 。4 测定方法4.1 供试品溶液的制备 精密量取样品20 mL,置于用水湿润过的60 mL分液漏斗中,加饱和氯化钠溶液5mL,用乙醚提取3次,每次20 mL,振摇1 min,合并提取液,水浴(60~65 ℃)蒸干,用无水乙醇溶解残渣,定量转移至1mL容量瓶中,并稀释至刻度,作为薄层色谱分离的供试品溶液。4.2 TLC分离和HPLC测定 精密量取上述供试品溶液200 μL,点于含0.5 % CMC硅胶G薄层板上(10 cm×20cm,层厚0.5 mm,105 ℃活化30 min,点成5 cm条状),另点1 mg.mL-1原儿茶醛对照品无水乙醇溶液2μL于另一侧作对照,用展开剂氯仿-苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶10∶8∶1.8)展开,取出挥干溶剂,晾干30 min,于360nm紫外光灯下(见图1),以原儿茶醛对照品前后亮黄色荧光条斑为界划痕,刮取划痕内硅胶粉,置具塞离心管中,加入无水乙醇10mL,用力振摇1 min,离心(3000 r.min-1,5min),倾出上清液。如此反复洗脱3次,合并洗脱液,蒸干,残渣用适量甲醇分数次溶解并转至1 mL容量瓶中,挥去溶剂,精密加甲醇1mL,振荡使溶解,吸取10 μL进行测定(见图2-A),用二点内插法计算原儿茶醛含量,即得。4.3 空白检查 取不含丹参的空白样品(940624)20mL,按项“4.1”、“4.2”操作,吸取10μL注入液相色谱仪(见图2-B),可见空白样品在原儿茶醛出峰处无干扰峰。5 加样回收率测定准确量取已测知含量的样品,定量加入不同浓度水平原儿茶醛对照品溶液,按上述测定方法测定6 重复性测定取40 μg.mL-1对照品溶液10 μL进样,连续6次,测得峰面积的RSD 为 0.11 %。7 样品测定取样品20 mL,按项“4.1”、“4.2” 方法处理,进样10μL,测定910314、920815、931014批号样品含量分别为3.191、3.063、3.108 μg.mL-1(n=3),RSD分别为0.22 %、0.31 %、0.19 %。8 讨论8.1 采用不同溶剂提取样品后直接溶解进样,分离效果不理想,图谱杂乱。用柱层析和薄层法进行预处理结果比较,以薄层法简单易行,甩掉部分杂质干扰,液相色谱图谱清晰。8.2 在360nm紫外线下,原儿茶醛斑无荧光,故以原儿茶醛对照品斑前后亮黄色荧光条斑为界刮下洗脱,保证样品中原儿茶醛全部被刮下。8.3 在样品预处理时曾采用氯仿、甲酸乙酯、苯及乙醚进行萃取,结果以乙醚提取为佳,3次提取回收率为99%。加入饱和氯化钠以防止提取时乳化物产生。
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