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血红蛋白电泳检查（电泳法）

1. 原理
血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。正常人血红蛋白多肽链包括α、β、δ和γ。血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中的泳动率不同。本实验在碱性（PH=8.60）条件下，以琼脂糖凝胶电泳的方法进行，对红细胞洗涤后造成溶血，电泳分离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗去。待琼脂糖凝胶板干燥后，肉眼可直接判别有无电泳条带异常。运用光密度扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情况。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。
2. 标本采集
2.1 标本采集前病人准备：受检者应空腹。
2.2 标本种类：抗凝血
2.3标本要求：抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中，充分混匀。
4. 标本储存：储存于2-8℃冰箱中，5天。
5. 标本运输：储存于2-8℃状态下的**或泡沫箱密封运输。
6. 标本拒收标准：**污染、溶血或脂血标本不能作测定。
7. 试剂
7.1 试剂名称：血红蛋白电泳检查试剂
7.2 试剂生产厂家：法国Sebia公司
7.3 包装规格：150tests
7.4 试剂盒组成
琼脂糖凝胶 10块溶血素 1瓶
缓冲液条带 10包×2条薄滤纸 1×10张
氨基黑（浓缩液）1瓶×100ml 点样模具滤纸 10条×1盒
7.5 试剂储存条件及有效期：贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃），不能冷冻。有效期两年。
8. 仪器设备
8.1 仪器名称：SEBIA电泳仪
8.2 仪器厂家：法国Sebia公司
8.3 仪器型号：HYDRASYS
9. 操作步骤
9.1血红蛋白液制作：抗凝血离心，5000rpm，5分钟，去掉血浆，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，若红细胞体积小于10ul，需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶血液造成溶血。震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟待测。
9.2 启动电泳仪
9.3将加样器放在一平板上，有数字的一端向上。各加样孔加入10ul溶血的样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟，使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。
9.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE时选择仪器的“HBTOTAL”程序（位于链盘左侧）。
9.5 从包装袋内取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支架。
9.6取出凝胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体，然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边缘对齐边线。略略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。
9.7 降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。
9.8 从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿端保护框。将加样器放在4号位置。
9.9 关上电泳仪盖子，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始。
9.10 凝胶染色扫描
9.10.1 打开盖子
9.10.2 取出并丢弃加样器
9.10.3 升高两个支架，握住塑料端取出并丢弃缓冲条。
9.10.4 打开凝胶托架，平放，将干燥的凝胶片放入两层间，然后关上托架。
9.10.5 将凝胶支架放入染色池
9.10.6 取出凝胶支架，打开盖子，取出干燥的凝胶片。
9.10.7在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。使用HYDRYS，DVSE或PREFERENCE光密度仪时，使A2片段的标记置于扫描板5mm的标志处。
10. 结果判断与参考范围
扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出胶片后，首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适，主要看基质带的浓度，如基质带浓度过淡，说明溶血液的浓度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。
半岁-**:HbA≧94.5﹪,HbF﹤2.0％,HbA2﹤3.5％
1个月：HbA 12-40﹪,HbF 60-93％,HbA2 0.1-1.0％
6个月：HbA 86-98﹪,HbF 0.84-10.7％,HbA2 0.87-2.9％
脐带血：HbA 4-40﹪,HbF 30-96％,HbA2﹤1.0％
11. 质量控制
建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白A,F,C和S的血样本。
12. 临床意义
12.1 检测β-地中海贫血
12.1.1 轻型：HbA2轻度升高，大多在4％-8％
12.1.2 中间型：HbA1A2缺如，HbF可达10％
12.1.3 重型：HbF：30％-90％，HbA多低于40％或甚至0％
12.2 检测α-地中海贫血
12.2.1标准型α-地中海贫血：新生儿期HbBart′s可达5％-15％，几个月后消失。经煌焦油蓝温育后，少数红细胞内有H包涵体。血红蛋白电泳无异常发现。
12.2.2血红蛋白H病：HbH在PH8.6或8.8电泳时，向阳极方向移动，泳速快于HbA;在PH6.5电泳时，仍向阳极方向移动。
12.2.3 血红蛋白Bart胎儿水肿综合症：Hb Bart′s占80％-100％，可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。
12.3 检测血红蛋白病：引起临床注意的异常血红蛋白有四种：S，C，E和D。
12.3.1 血红蛋白S：在碱性缓冲条件下血红蛋白S的条带位于A和A2片段之间
12.3.2血红蛋白C：在碱性缓冲条件下血红蛋白C，E和A2的条带重叠在一起。若这一片段﹥15％，应怀疑有血红蛋白C或E的异常。
12.3.3 血红蛋白E：与血红蛋白C不同的是，E在酸性凝胶电泳中不与A2分离。
12.3.4 血红蛋白D：在碱性缓冲条件下，血红蛋白D和S的条带重叠在一起，但D在酸性凝胶电泳中不与A2分离。
13. 操作性能：灵敏度高、特异性强、操作简便，重复性好。
14. 注意事项：
14.1 试剂贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃）内，不能冷冻。
14.2 不要应用溶血标本
14.3若检测到异常血红蛋白，而又与常见的异常血红蛋白S,C,D或E不同，可使用其他方法（如球蛋白链电泳）检测，或求助于有关专门实验室。
14.4 HbF小于全部血红蛋白的2％-3％时，扫描检测HbF（或其它一些较少见的血红蛋白）只是半定量的，结果不十分准确。
14.5 对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大为15ul或20ul，其结果不受影响。
14.6 电泳过程中不能打开盖子。在染色脱色以及干燥过程中，仪器的一些程序处于锁定状态。
14.7 *后染色后立即扫描测定。若欲保存，可用一保护物覆盖后置于干燥、暗处，避免受热，可保存约3个月。

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