食物中氨基酸的测定方法

7.2标准出峰顺序和保留时间
序号 出峰顺序 保留时间/min 序号 出峰顺序 保留时间/min
1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63
2 苏氨酸 6.60 10 异亮氨酸 21.24
3 丝氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06
4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52
5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76
6 甘氨酸 12.24 14 组氨酸 30.41
7 丙氨酸 13.10 15 赖氨酸 32.57
8 缬氨茇 16.65 16 精氨酸 40.75

7.3允许差： 同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差**值≤12%。

二、食物中胱氨酸的测定方法---氨基酸自动分析仪法（过甲酸氧化）
1.原理
在用盐酸水解蛋白质的过程中，胱氨酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反应如下：
SH NH2 O SO3H NH2 O
CH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH
半胱氨酸 过甲酸 半胱磺酸 甲酸

生成的半胱磺酸可在氨基酸自动分析仪上进行测定，与标准半胱磺酸比较，计算其含量。
2.适用范围
参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。适用于食物中胱氨酸的测定。
3.仪器
水解瓶：耐压螺盖玻璃管或硬质试管，体积20～30mL，用去离子水冲净并烘干，电热减压蒸发器。
4.试剂
过甲酸：取9mL分析纯甲酸加入1mL30%过氧化氢混合，在室温放置2小时以上。
5.操作步骤
5.1过甲酸氧化：称取一定量的食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质在5～10mg，加入1mL过甲酸试剂，在室温放置3小时。加1mL乙醇终止氧化。将样品瓶置于电热减压器中，于45℃减压蒸干，用1mL去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次，以除去过甲酸。
5.2盐酸水解：同食物中氨基酸（16种）测定方法
5.3在Bekman6300氨基酸自动分析仪上，在注文50℃时用pH3.25柠檬酸缓冲液洗脱，半胱磺酸的出峰时间约在1.78分钟。
6.计算
上机样品液（50μl）中半胱磺酸量=
上机标准液中半胱磺酸量（nmol）×样品峰面积
半胱磺酸标准峰面积

100g样品中胱氨酸mg数=
上机样品中半胱磺酸量（nmol）×D×M×100
W×E×106×2
式中
D：样品稀释倍数
M：胱氨酸分子量（ng）
W：称样量（g）
E：上机时的进样量（此处为50μl）

三、食物中色氨酸的测定--荧光分光光度法
1.原理
食物中蛋白质在酸水解过程中，其色氨酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在pH为11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点，可在有大量酪氨酸的存在下，检测色氨酸的含量。
2.适用范围
参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。适用于食物中色氨酸的测定。
3.仪器
3.1荧光分光光度计
3.2减压蒸发器
3.3螺旋盖大口瓶（瓶盖要有橡皮垫）
3.4聚四氟乙烯管
3.5小玻璃球
3.6烘箱
4.试剂
（1）5mol/L NaOH：内含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。
（2）4mol/L 尿素（pH=11）
（3） 6mol/L盐酸
（4） 溴百里酚蓝指示剂：称取0.1g溴百里酚蓝加0.1mol/L氢氧化钠1.6ml，配成0.05%水溶液。
（5） 高纯氮（含量99.999%）
（6） 辛醇甲苯溶液：内含1%辛醇
（7） 色氨酸标准液：（1mg/ml）：称取色氨酸标准，用0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，贮存于冰箱保存。
5.操作步骤
5.1称取含粗蛋白质约5mg的食物样品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氢氧化钠1ml，加入1滴辛醇。
5.2将各管分别盖上小玻璃球，放入1只带螺旋盖的大口玻璃瓶中，将瓶置于减压蒸发装置中，加冰和盐降温，减压至真空度1.3Kpa10mmHg以下，继续保持15min，充氮气再减压，如此反复3次，迅速旋紧大口瓶的螺旋盖。
5.3将充氮气的大口瓶置于烤箱内，在110℃水解样品22小时。
5.4冷却大口瓶，用重蒸馏水将样品分别洗至25ml容量瓶中，（内含6N Hcl0.7ml）用溴百里酚蓝为指示剂调pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取样品液1ml，于10ml带盖试管内，用pH11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm，发射波长为360mm下测定荧光强度，根据标准色氨酸的荧光强度曲线，计算样品中色氨酸含量。
5.6色氨酸标准曲线：用前将标准贮备液稀释成每ml含100，200，300，400μg的色氨酸标准系列。取每种浓度的标准液各1ml（双份）与样品管同样加试剂，同时水解，以色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算
每100g样品中的色氨酸含量（mg）=
A×D×100
1000×W
式中
A：根据标准曲线得到的每ml测定液中色氨酸的含量（mg）
D： 稀释倍数
W： 取样量（克）