紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力

   摘要：脂肪氧化酶(LOX)是一种含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。它广泛存在于高等植物体内，与植物的生长发育、植物的衰老、脂质过氧化作用和光合作用、伤反应及其他胁迫反应等有关。

1引言

小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亚油酸，使WG短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化LOX。为了*大限度地保护WG营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而LOX活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系pH、反应温度、底物及Tween浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX的*适pH和*适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的WG中LOX的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。

2实验部分

2.1仪器与试剂DU800核酸蛋白分析仪(Beckman公司);BR4冷冻离心机(Jouan公司);pHS3B精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka公司);其它试剂均为分析纯。

2.2样品制备取10g小麦胚芽，粉碎，加入100mL0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)，4℃下搅拌30min，悬浮液12000r/min离心30min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。

2.3底物的配制取111μL亚油酸，无水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTween20。减压蒸去乙醇，残余物溶解在50mL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53mmol/L。

2.4酶活的测定检测波长234nm，温度25℃;反应液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;参比液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL钝化处理的粗酶液。

3结果与讨论

3.1底物在不同pH条件下的稳定性底物溶液分别用pH4.5～9.0的缓冲溶液稀释10倍，随着时间的延长，由于亚油酸在酸性条件下溶解度下降，产生浑浊，由于光散射导致吸光度增大。pH值越低，吸光度变化速度越快;pH4.5时达0.19%。而pH8.0和9.0的底物溶液比较稳定，吸光度在2h内基本保持不变。选择pH7.0缓冲液稀释底物，每隔15min测定粗酶液酶活一次。由于亚油酸溶解度的下降，参与催化反应的底物量减少，导致同样的酶液LOX酶活力2h后测定值仅为初始值的69%。为此，本实验采用亚油酸Tween无水乙醇混合体系配制反应底物，使亚油酸完全溶解在Tween中，再通过滴加NaOH，能方便地获得透明的底物溶液。酶活测定时，在反应体系首先加入底物和所需pH值的缓冲液，稳定5min，再加入待测酶液，能有效消除在中性和酸性缓冲体系下，亚油酸溶解度下降产生的误差。

3.2底物浓度的优化将不同浓度(0.31～15mmol/L)的底物溶液，用pH7.0缓冲溶液稀释10倍，进行全波长扫描。随着底物亚油酸浓度的增加，234nm处吸光度逐渐上升;当底物浓度大于5.0mmol/L时，溶液的吸光度为0.77，如再加入酶液，反应体系的吸光度很快上升到2.0，将产生较大误差。底物浓度小于2.5mmol/L，溶液的初始吸光度则低于0.23。酶活测定时，反应体系吸光度3min内上升到1.23，符合分光光度分析吸光度在0.1～1.0时线性关系*佳的要求。当底物浓度小于6.25×10-4mol/L，由于亚油酸浓度过低，线性关系差。亚油酸的适合浓度范围为1.25～2.50mmol/L。

3.3Tween浓度的影响配制3种含不同浓度Tween20的底物溶液(亚油酸浓度均为2.53mmol/L)，测定酶活。结果表明，Tween20有效增加了亚油酸在缓冲溶液中的溶解度，特别是在pH>8的碱性条件下。然而随着底物溶液中Tween20浓度增加到0.24%，Tween开始对LOX产生竞争抑制。Tween的合适浓度范围为0.08%～0.16%。

3.4pH的影响LOX在pH4.5～8.5范围，均具有较高活力，*适pH为6.5。当pH>9.0时酶活力开始减弱。综合3.1中pH对底物稳定性的影响，*适pH范围为6.5～7.5。在pH7.0下，RSD=7.2%(n=8)。

3.5温度的影响在0～45℃,提高温度能显著增强LOX的活力;随着温度进一步升高，活力开始下降，超过55℃时活力迅速下降，至65℃完全失活。综合考虑，反应温度选择25～35℃。在25℃下，RSD=5.3%(n=8)。

3.6方法线性范围、回收率及精密度粗酶液中蛋白值含量为122.5mg/L。在粗酶液添加量5～70μL范围内对LOX酶活进行分析，得到线性方程ΔA234/min=0.0053V-0.0075(ΔA234/min为每分钟吸光度的变化;V为加酶量，μL)，r=0.9984。添加20μL粗酶液，添加回收率为88.3%，RSD=6.9%(n=8)。
 

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