食物中硒的测定

食物中硒的测定

荧光法
1. 原理
样品经混合酸消化后，硒化合物被氧化为四价无机硒（Se4+）,与2，3二氨基萘（2,3-diaminonaphthalene,简称为DAN）反应生成4，5－苯丙丕硒脑（4,5-benzopiaselennol）,其荧光强度与硒的浓度在一定的条件下成正比。用环己烷萃取后于激发光波长376nm,发射光波长520nm处测定荧光强度与绘制的标准曲线比较定量。本方法检出限为3ng。
2. 方法来源
GB/T 12399 -1996，本方法是测定食物中微量元素硒的国家标准方法。
3． 仪器和设备
1) 实验室常用设备
2) 荧光分光光度计
4. 试剂
除说明外均为分析纯。实验用水为去离子水。
4.1 环己烷
4.2 硝酸
4.3 过氯酸
4.4 盐酸
4.5 氢溴酸
4.6 （1＋9）盐酸溶液
4.7 (1+1)氨水
4.8 (5+95) 去硒硫酸：取5ml去硒硫酸，加入95ml水中。
去硒硫酸：取200ml硫酸，加于200ml水中，再加30ml氢溴酸，混匀，置沙浴上加热蒸去硒与水至出现浓白烟，此时体积应为200ml。
4.9 0.2 mol/L EDTA: 将37g EDTA二钠盐，加水并加热溶解，冷却后稀释至500ml。
4.10 10% 盐酸羟胺：称取10g盐酸羟胺溶于水中，稀释至100ml。
4.11 混合酸：硝酸＋过氯酸（2＋1）
4.12 0.1% 2,3-二氨基萘（纯度为95～98%）： 需在暗室配制，称取200mgDAN于一带盖三角瓶中，加入200mL0.1mol/L盐酸，振摇约15min，使其全部溶解，约加40mL环己烷，继续振摇5 min ,���此液体转入分液漏斗中，待溶液分层后，弃去环己烷层，收集DAN层溶液。如此用环己烷纯化DAN直至环己烷中的荧光数值降至*低时为止（纯化次数视DAN纯度不同而定，一般约需纯化3－4次）。将提纯后的DAN溶液储于棕色瓶中，约加1㎝厚的环己烷覆盖溶液表面。置冰箱中保存。必要时再纯化一次。
4.13 硒标准溶液
A) 硒标准储备液（100μg/mL）： **称取100.0mg元素硒（光谱纯），溶于少量硝酸中，加2mL过氯酸，置沸水浴中加热3－4h，冷却后加入8.4mL盐酸，再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL，其盐酸浓度为0.1mol/L。此储备液浓度为100μg/mL。
B) 硒标准使用液（0.05μg/mL）：将4.13.1液用0.1mol/L盐酸稀释，使含硒为0.05μg/mL。于冰箱中保存。
4.14 0.02％甲酚红指示剂：称取50mg甲酚红溶于水中，加（1＋1）氨水1滴，待甲酚红完全溶解后加水稀释至250mL。
4.15 EDTA混合液：取0.2mol/L的EDTA（4.9）和10％盐酸羟氨（4.10）液各50mL，混匀，再加5mL（4.14）溶液，用水稀释至1L。
5. 分析步骤
5.1 样品处理及消化
1) 粮食：样品用水洗三次，于60℃烘干，用不锈钢磨磨成粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧盖保存，备用。
2) 蔬菜及其他植物性食物：取可食部分用水冲洗三次后用纱布吸去水滴，用不锈钢刀切碎，取混合均匀的样品于60℃烘干，称重，粉碎，备用。
3) 称取0.5－2.0g样品（含硒量0.01－0.5μg）于磨口三角瓶内，加10mL（5＋95）去硒硫酸，样品润湿后，再加20mL混合酸液放置过夜。次日于沙浴上逐渐加热，当激烈反应后（溶液变无色），继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡黄色即达到终点。某些蔬菜样品消化后常出现浑浊，难以确定终点，所以要细心观察。另外，含硒较高的蔬菜含有较多的Se6+，需要在消化达到终点时冷却后加10mL（1＋9）盐酸，继续加热，使Se6+还原成Se4+。同样按上述方法确定终点。
5.2 测定
于样品消化液中加20mLEDTA混合液，用氨水（1＋1）或盐酸调至淡红橙色（pH 1.5～2.0）。以下步骤在暗室进行：加3 mLDAN试剂，混匀，置沸水浴中煮5min，取出立即冷却，加3mL环己烷，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，环己烷层转入带盖试管中，小心勿使环己烷中混入水滴，于激发光波长376，发射光波长520nm处测定丕硒脑的荧光强度。
5.3 硒标准曲线绘制：准确吸收硒标准使用液0，0.2，1.0，2.0及4.0mL加水至5mL，按样品测定步骤同时进行。硒含量在0.5μg以下时荧光强度与硒含量呈线性关系，在常规测定样品时，每次需做试剂空白与样品硒含量相近的标准管（双份）即可。
6．结果

式中：X--样品中硒含量，μg/g；
A--标准管荧光读数；
B--空白管荧光读数；
C--样品管荧光读数；
m1--标准管中硒质量，μg；
m2--试样质量，g。
7．注意事项
7.1 结果的允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差**值≤10％。
7.2硒含量在0.5μg以下荧光强度与硒含量呈线性关系，超过0.5μg时为非线性关系，故硒含量应控制在0.5μg以内。硒含量过高时要先用环己烷稀释样品，再测定荧光。
7.3我国高硒地区���物样品中的硒，多以Se6+形式存在，故应在消化到终点后，加（1＋9）HCl还原后继续消化至终点再测定。