食物中泛酸的测定方法

微生物测定法

1.原理
泛酸对于Lactobacillusplantarum（ATCC8014）的正常生长是一种必需的营养素，在一定生长条件下，Lactobacillusplantarum的生长与繁殖速度同样品中泛酸的含量成一定的线性关系，通过利用浊度法或光密度法测定**增殖的强度即可间接地检测出食物样品中泛酸的含量。本方法*低检出限为5ng。

2.适用范围
本方法参考"Official Methods of Analysis of the Association ofofficialAnalytical Chemists"、"Methods of VitaminAnalysis"以及"Methods of theMicrobiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法适用于测定各类食物（包括天然食物及加工食物）及饲料中的泛酸含量。
3.试剂
本试验用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1甲苯
3.2 1mol/L盐酸溶液
3.3 Tris缓冲溶液：将24.2三羟基氨基甲烷溶于150ml水中，用7.5mol/LNaOH调pH至8.0~8.3，然后定容至200ml，贮存于4℃冰箱中，可保存2周。
3.4 7.5mol/L氢氧化钠溶液：溶150g氢氧化钠于水中，定容至500ml。
3.5 2mol/L醋酸：12ml冰醋酸用水定容至1000ml。
3.6 2mol/L醋酸钠溶液：将16.4g醋酸钠用水定容至1000ml。
3.7 2mol/L碳酸氢钾溶液：称取10.012g碳酸氢钾溶于水中，然后定容至500ml。
3.82%碱性磷酸酶溶液：称取2g碱性磷酸酶（Sigma公司No.P-3877）溶于水中，然后定容至100ml。贮存于4℃冰箱中保存。
3.910%鸽子肝脏提取物溶液：将所用容器在配制此试剂前**放入4℃冰箱中过夜。(1)称取30g鸽子肝脏丙酮提取物粉末（Sigma公司,No.L-8376）放入冷的研钵中，分两次加入300 ml 0.2NKHCO3,至0℃的冰浴中研磨均匀直至呈悬浊液；(2)将此悬浊液分别放入8支离心管中，塞紧后充分振摇，冷冻10分钟，然后3000转离心5分钟；(3)将上清夜放入500ml预冷的广口烧瓶中，加150g活性Dowex1-X8（Bio-RadLaboratories, Inc.,Brussels, Belgium）,放在冰浴中震摇5分钟；将混合液倒入离心管中，3000转离心5分钟；(4)再将上清液移入另一个冷的500ml广口烧瓶中，冷冻10分钟；(5)重复上述(3)、(4)步骤一次；(6)然后分装于试管中，冷冻条件下保存，用前化冻。
3.10 酸解酪蛋白液：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200ml3mol/L盐酸，于压力蒸汽**器内10.3×104Pa（15lb/in2）压力下水解6小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，贮存于试剂瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
?酸解的目的是为了去除酪蛋白中的维生素，使基本培养基中不含待测定的维生素，但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉，这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.11 胱氨酸-色氨酸溶液：称取4g L-胱氨酸和1gL-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加热至70-80℃，逐滴加入（1+5）的盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
3.12腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
3.13 吐温80溶液：将25g吐温溶于乙醇中并定容至250ml。
3.14维生素溶液Ⅰ：称取20mg核黄素，10mg盐酸硫胺素，0.04mg生物素，用0.02mol/L醋酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15维生素溶液Ⅱ：10mg对氨基苯甲酸，50mg尼克酸，40mg盐酸吡哆醇，溶于（1+3）的乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 盐溶液A：称取25g磷酸二氢钾和25g磷酸氢二钾溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。
3.17 盐溶液B：称取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO47H2O、23ml 85% H3PO4，溶于水中并定容至500ml。
3.18 泛酸标准溶液

3.19基本培养基：将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH至6.8，用水稀释至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
维生素溶液Ⅰ 5ml
维生素溶液Ⅱ 5ml
盐溶液A 5ml
盐溶液B 5ml
无水葡萄糖 10g
三水醋酸钠 8.3g
吐温80溶液 0.25ml
此培养基也可从Difco公司购得，产品号为0816-15-7。
? 由于国内的某些试剂纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，严重影响到*后的浊度测定结果，因此建议使用进口培养基。
3.20琼脂培养基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖，2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml吐温80，加热溶解，用40%氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000ml，每500ml液体培养基加5.0~7.5g琼脂，于121℃高压**10分钟，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱2-4℃条件下保存。
3.21生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中，。每次使用时分别到入2~4支10ml试管中，每支约加10ml，塞好棉塞，于121℃高压**10分钟，备用。
3.22 0.04%溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵内，加1.6ml0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
3.23 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4ml0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
3.24 0.1%溴酚蓝乙醇溶液：称取0.1g溴酚蓝，用乙醇溶解后，加乙醇稀释至100ml。
3.25 番茄汁：将新鲜番茄去皮、去籽，制成匀浆后，用纱布过滤数次，直至呈淡黄色透明液体，在液面上加几滴甲苯，冷冻保存。
4.仪器与设备
4.1 实验室常用设备
4.2 电热恒温培养箱
4.3 压力蒸汽**器
4.4 液体快速混合器
4.5 离心机
4.6 722分光光度计
4.7 硬质玻璃试管：20mm×150mm
5.菌种与培养液的制备与保存
5.1 储备菌种的制备：Lactobacillusplantarum（ATCC8014）接种于直面琼脂培养管中，在37±0.5℃恒温箱中培养16~24小时，取出后放入冰箱中保存，每隔两周至少传种一次。在实验前**必须传种一次。
5.2种子培养液的制备：加2ml泛酸标准工作液和3ml基本培养基于10ml离心管中，塞好棉塞，于121℃高压**10分钟，取出，冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。
?加入离心管中的泛酸标准液要适量，过少会影响Lactobacillusplantarum的生长，过多则不宜于洗净残余泛酸，因此会使零管中的光密度值增大，影响测定结果的准确性。一般2-3ml标准工作液即可。
6.操作步骤
6.1接种液的配制：使用前**，将已在琼脂管中生长16-24小时的L.plantarum接种于种子培养液中，在37±0.5℃培养16-24小时，取出后离心10分钟（3000rpm），弃取上清液，用已**的生理盐水淋洗2次，再加入3ml**生理盐水，混匀后，将此液倒入已**的注射器中，立即使用。
6.2 样品制备：
称取适量样品，放入100ml三角瓶中，加10mlTris缓冲液，加蒸馏水30ml，混匀于121℃高压条件下水解15分钟，取出冷却至室温，定容至50ml，过滤。
? 泛酸在空气中稳定，但对于热不稳定，因此水解时间切勿过长。
取1ml样品液（5.2.1.），加入0.4ml碱性磷酸酶溶液，0.2ml肝脏提取物溶液，0.1ml碳酸氢钠溶液，0.4ml蒸馏水，混匀后，37℃温箱中培养过夜。
加水至20ml，以溴甲酚绿为外指示剂，用冰醋酸调节pH=4.5，定容至25ml，过滤。
取适量水解液（5.2.3）于25ml具塞刻度试管中，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠调节至pH=6.8，用水定容至某刻度。
样品试管的制备：于平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0ml样品水解液（5.2.4），加水至5ml，然后再加入5ml基本液体培养基。
6.3标准管的制备
每组试管中分别加入泛酸标准工作液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml（相当0.0、10.0、20.0、 30.0、40.0、50.0ng泛酸），加水至5ml，再加入5 ml基本液体培养基， 需做三组标准曲线。。
6.4**：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121℃高压**10分钟。
?**时间不宜过长，否则会破坏基本培养基中的营养成分，影响Lactobacillusplantarum的生长，*好在5-10分钟内。
6.5 接种与培养：待试管冷至室温后，每管接种一滴种子液，于37±0.5℃恒温箱中培养16~20小时。
?（1）接种前，接种室要在紫外灯下**至少30分钟。（2）在接种时，其中一支标准系列0管可不接种，这样可观察此次实验是否存在污染，并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差。
6.6 测定：722分光光度计，波长640nm条件下，以标准系列0管仪器调零，测定样品管及标准管的吸光度值。
? 先以未接种的标准系列0管进行仪器调零，然后再用接种后的标准系列0管进行二次调零，之后再测定其他管中液体的光密度值。
7.计算
以泛酸标准系列的不同纳克数为横坐标，吸光度值为纵坐标，制做标准曲线。在曲线上查出相对应的样品测定管中的泛酸含量，然后再按以下公式计算样品中泛酸含量：
    C·V·F
X=-------------- ×100
     m×1000
式中
X ── 样品中泛酸含量，μg/100g：
C ── 测定管中的泛酸含量，ng：
V ── 样品水解液的定容体积，ml：
F ── 样品液的稀释倍数
m ── 样品质量，g。
100/1000 ── 单位换算系数