一．血红蛋白测定 （一）氰化高铁血红蛋白(HiCN)法 血红蛋白测定一般使用氰化高铁血红蛋白(HiCN)法。 1．操作：取血20µ1，加到5m1HiCN试剂中，充分混合，静置5分钟，以HiCN或蒸馏水为空白，用分光光度计波长540nm测吸光度，则测定管血红蛋白（g/l＝测定管吸光度×367.7）。 2．HiCN试剂的配法：***50mg，高铁***200mg，无水磷酸二氢钾140mg，TritonX-100 1.0ml，加蒸馏水至1000m1，此液为淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，波长540nm的吸光度为零。此液贮存在棕色瓶中，放冰箱保存，一般可保存数月。 3．注意事项：在使用HiCN法测定血红蛋白时应注意，试剂中的KCN为剧毒药品，废液需用除毒液处理。除毒液可用硫酸亚铁和NaOH 按2：1的比例研碎，配制成100g/L。在每1000ml废液中加入5ml除毒液搅拌3小时，即可使剧毒的***变成无毒的亚铁***。 （二）碱羟高铁血红素(AHD～575)法 1．操作：取血20µ1加到下述任何一种3m1反应液中，充分混合，静置3分钟，用反应液调零，用分光光度汁波长575nm处，测定吸光度(A)，则血红蛋白(g/l)＝测定管吸光度×349.7。 2．反应液的配法： ① 配方一： TritonX-100 25g，加0.1molNaOH至1000ml； ② 配方二：皂素1g，加0.1molNaOH至1000ml； ③ 配方三：Brij－35 25g，加0.1molNaOH至1000ml。 二．红细胞计数： 动物红细胞计数可用普通的血细胞计数器，也可用光电比浊法。 （一）计数方法（试管法） 1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3，擦去管**外部的余血。 2．迅速挤入盛有4ml红细胞稀释液的华氏小试管中摇匀，此时血液的稀释倍数为1／200。 3．将稀释液滴入计数池，静置3分钟，在高倍镜下数中央大方格中的5个中方格，将5个方格计数的红细胞数相加。 4．计算：5格的总和×1／50mm3（5个中格的体积）×1／200（稀释倍数）＝1／10000mm3。 故5格的总和×10000即为每1／2 mm3 内的红细胞数。 （二）红细胞稀释液的配制 1．配方一： 氯化钠 0.8g 蒸馏水 1000ml 2．配方二： 氯化钠 9g 重碳酸钠 1g 蒸馏水夹至 1000ml 三．白细胞计数： （一）计数方法 与红细胞计数一样，可用普通的血细胞计数器，也可用电子血细胞计数机计数。 1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3，擦去管**外部的余血。 2．立即挤入盛有0.4ml白细胞稀释液的小试管内，充分摇匀。 3．将混悬液滴1小滴入计数池。 4．静置3分钟，待白细胞下沉后，在低倍镜下数四角4个大方格的白细胞数。 5．计算：4个大方格的体积为4／10mm3，血液稀释倍数为20倍。故4格白细胞数的总和×4／10×1／20=1／50mm3，4格白细胞总数×50=lmm3的白细胞总数。 （二）白细胞稀释液的配方 冰醋酸(纯) 200ml 蒸馏水加至 1 000ml 稀释液内加入少许结晶紫或美蓝，呈浅紫色，以资识别，并可使白细胞更明显。 四．白细胞分类计数 （一）计数方法 1．采血：常法取动物末梢静脉血滴于载玻片的一端。 2．取1片边缘光滑平整的玻片作推片，先放血滴前方，两者成30～35°角，将推片稍向后拉，并左右移动使血滴形成一线，粘着推片边缘。 3．将推片由1端向另1端平稳地推进，用力须均匀，直至血液推尽为止。推片角度的大小可控制血片的厚薄，角度大、移动快则血片厚，相反则血片薄。应移动稍快不加压力将血液推成薄膜。 4．将推好的血片置于空气中完全干燥。一般良好的血片应有头、体、尾3部分，血膜开始端较厚，末端较薄，玻片两侧及两端都有适当空余部位。 5．染色：将血片需染的部分两端用蜡或蜡笔画一线，防止染液流出。把血片放在染色架上或平台上，滴瑞氏染液5—7滴，盖满整个血膜，l min后加等量磷酸缓冲液。在常温下染色l0min，用水冲洗。将染好的血片直立于空气中，待镜检。 6．计数：先在低倍镜下**观察已染血片，可略知细胞分布情况、染色好坏，以及对白细胞总数作出初步估计。选择血片厚薄均匀，在血片体、尾部之间，转换油镜下数满100—200个白细胞。一般白细胞���数在10 000左右数100个，10 000以上数200个。将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、**细胞、单核细胞分别记录在血细胞分类计数器上，求出百分率。 l张染色好的血片，在显微镜下红细胞呈橘红色，中央色淡；白细胞核呈紫红色，嗜中性粒细胞呈浅红紫色或粉红色；嗜酸性粒细胞呈亮红色；嗜碱性粒细胞呈暗紫色；**细胞浆呈浅蓝色；单核细胞浆呈极浅蓝色。 （二）染液和缓冲液的配置 1．染液的配置： 瑞氏染粉 0.1g 中性甘油 3ml 甲醇 60ml 配法：准确称取瑞氏染粉，放入洁净研钵中研细。加入中性甘油再研，加入少量甲醇再研。将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，再加入少量甲醇研磨，如此直至染料全部溶解，加甲醇至需配置容量。混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。一般配置后在常温下保存一周即可使用。 2．缓冲液配置（pH6.4）： 10％无水磷酸二氢钾 30ml 10％无水磷酸氢二钠 20ml 蒸馏水加至 1000ml 五．血小板计数： （一）计数方法 1．小试管内加血小板稀释液0.4ml。取动物静脉血20mm3，迅速挤于稀释液内，立即充分摇匀。 2．放置4—10min，待溶液呈透明红色，说明红细胞已经充分溶解，充分摇匀，取1小滴加入计数池。 3．放置10－15min，待血小板完全下沉后，先将中央大方格移至低倍镜视野内，再转以高倍镜，数5个中方格内的血小板数。 4．血小板大小形态不一致，但均呈折光的发亮淡蓝色小点，大小约红细胞的1／7—1／2，呈不规则圆形或长圆形。在计数时必须来回扭动显微镜微调，不要遗漏计数。 5．计算：5个中方格血小板总和×1／50mm3(5个中方格的体积)×1／20(稀释倍数)=1／1 000mm3。 故5个中方格的总和×1 000=l mm3血液的血小板数。 （二）血小板稀释液的配置 1．配方一：尿素稀释液： 尿素 1.3g 枸橼酸钠 0.5g 甲醛 0.1ml 蒸馏水加至 100ml 将尿素、枸橼酸钠溶于蒸馏水中，然后加入甲醛。为方便观察，可加入少许美蓝，放冰箱保存，用前必须过滤。 2．配方二：1％草酸铵稀释液： 草酸铵 1g 蒸馏水加至 100ml 六．网织红细胞计数 （一）计数方法 1．在小试管中滴加1滴煌焦油蓝生理盐水溶液，再加入末稍血 2滴，充分混合均匀。 2．静置15～20分钟后，取1滴制成薄片。 3．油镜下检查1000个红细胞中的网织红细胞数，以百分率表示。 网织红细胞**值计算：网织红细胞数／µ1＝（网织红细胞％×红细胞数／µ1）/100 （二）煌焦油蓝生理盐水溶液配制： 煌焦白蓝 1g 枸橼酸钠 0.4g 氯化钠 0.85g 蒸馏水加至 100ml 过滤后备用 七．骨髓细胞计数： 将小鼠颈椎脱位处死，取l根股骨，用10ml 3％醋酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数器上计数4个大方格的细胞数，所得细胞数乘以2．5 x 100 000，即为1根股骨中骨髓有核细胞数。2.5 × 100 000表示稀释倍数。 4个大方格的体积为0.4mm3，而1000mm3＝l mL，现稀释成10mL，所以乘2.5 × 100 000。 八．红细胞比积及红细胞沉降率的测定 （一）红细胞比积的测定 1．温氏管法：静脉采血2ml，注入抗凝管中，充分混匀，再用细长毛细滴管吸取混匀的抗凝血，插入红细胞比积管底部，然后将血液缓慢注入至刻度“10”处，水平离心机以3000rpm离心30分钟，读取红细胞层柱高的毫米数。再离心10分钟，至红细胞不再下降为止，乘以0.01，即为每升血液中红细胞体积（L/L）。 2．毛细管法：使用虹吸法取外周血充进毛细管内，把毛细管的一端插入橡皮泥中，封口，高速离心机12000rpm 5分钟，测量血液总长度和红细胞长度，计算红细胞所占百分率。即为红细胞比积。 （二）红细胞沉降率的测定 取直径为3mm的试管1支，加入抗凝剂0.4m1，常规静脉采血后，将血加入试管至2ml，混匀，用血沉管吸取上述混匀血液至“0”刻度处。将管直立在血沉架上，室温静置l小时。观察血浆高度，红细胞下沉的毫米数即为结果。 在测定红细胞沉降率时应注意：标本采集时要避免脂肪血；血液和抗凝剂比例要准确；放置要垂直；做血沉的标本要在采集后3h内测定，并充分混匀；血沉应在18～25℃室内测定。