第五十八期 抗体**异构体的HPLC色谱柱分析

第五十八期 抗体**异构体的HPLC色谱柱分析
 

抗体**的开发是目前全球生物技术产业的热点，在生物制药领域占有极其重要的地位，被认为是目前生物医药研发的主流方向之一。目前在世界销售额前10位的生物**中，抗体**就占了4个。

单抗**由于具有靶向性强、半衰期长、副作用小等优点，在**重大**方面受到重视。单克隆抗体是一种生物大分子，由多个氨基酸组成，结构复杂，在细胞培养、纯化、储存过程中易发生化学修饰如糖基化、磷酸化、化学降解等，所以需要多种方法进行检测分析。

高效液相色谱法（HPLC）可以对抗体**以及重组蛋白等蛋白**的不均一性进行有效的分析。多种色谱分析方法的有效组合，能够更好地进行蛋白**的定量和定性分析。例如，分子尺寸排阻色谱法（SEC）可以利用分子尺寸的不同，对多聚体、片段、PEG化蛋白等样品进行有效的分析；离子交换色谱法（IEC）、疏水作用色谱法（HIC）、反相色谱法（RPC）、正相色谱法（NPC/HILIC）可以对带电异构体、构造异构体、糖基化、脱酰胺化及氧化等变化引起的杂质进行高分辨率、高效分析。分离选择性取决于色谱分离模式、色谱柱的种类和色谱条件等。

以下对抗体**异构体的HPLC分析，进行简单的介绍。抗体**的高效液相色谱分析的分离模式，主要有以下几种：

一、尺寸排阻色谱法（SEC）--根据分子尺寸的不同，对多聚体、分解片断进行分析。

常用的柱子是TSKgel G3000SWXL。TSKgel SW 型色谱柱属于硅胶基质色谱柱，键合了亲水性二醇基官能团以保护硅胶表面不与蛋白样品相互作用。与其他竞争产品比较，SW型色谱柱单位柱体积的孔隙容量更大，能产生更高的分子量选择性范围和更高的分辨率。低吸附作用和均匀的孔径分布能实现蛋白质的高效分离。

1. 抗体多聚体的SEC分析

2. 胃蛋白酶酶解抗体的过程跟踪

3. 单抗PEG化的分析(PEG:5 kDa)

4. 半抗原结合抗体片段的分析

二、离子交换色谱法（IEC）--根据带电性的不同，对氨基酸残基的不同、脱氨基化、N末端和C末端的变化进行分析。

离子交换介质的表面构造如下图：

常用的柱子是TSKgel CM-STAT。TSKgel STAT系列为生物高分子（蛋白质，多肽，核酸）分离用的聚合物系离子交换色谱柱。使用非多孔性填料，在通用HPLC系统中可实现超高速、超高效分离。

1. 抗体**IEC分析实例1（单抗带电异构体的分析）

2. 抗体**IEC分析实例2（C末端赖氨酸残基的酶处理）

3. 抗体**IEC分析实例3（Asn脱酰胺化及异性化分析）

三、疏水相互作用色谱法（HIC）--根据立体构造（疏水性）的不同，对氨基酸残基的不同、多聚体进行分析。

常用的柱子是TSKgel Butyl-NPR。TSKgel Butyl-NPR是一款以粒径为2.5μm的，丁基键合无孔型亲水性聚合物基质为填充物的疏水作用色谱柱。适用于蛋白质、单抗、酶等生物大分子的分离分析。

1. 抗体的HIC分析实例1（使用硫酸铵作为盐淋洗液）

2. 抗体的HIC分析实例2（使用NaCl作为盐淋洗液）

3. 抗体的HIC分析实例3（脱酰胺化异构体分析）

4. 抗体的HIC分析实例4（Met氧化后的片段分析）

四、反相色谱法（RPC）--根据分子量的不同（疏水性），对氨基酸残基的不同进行分析。

常用的柱子是TSKgel Protein C4-300。色谱柱采用粒径为3μm、孔径为30nm、键合了丁基(C4)的硅胶填料充填，是一种用于分离生物大分子的高性能反相色谱分析柱。对蛋白质保留较强，分离选择性优异；对一般水溶性蛋白质的回收率高，能保持尖锐的峰形。3μm的填料粒径，可以实现高通量、高分辨率、高灵敏度的分析检测。2mm内径的色谱柱适用于LC/MS/(MS)联用分析检测。

1. 抗体的RPC分析实例1（抗体木瓜蛋白酶消化物的分析）

2. 抗体的RPC分析实例2（抗体**二硫键还原物的分析）