胶束电动高效毛细管电泳法测定山楂中的芦丁

胶束电动高效毛细管电泳法测定山楂中的芦丁

马继平，吕玮峰，丁明玉*

（清华大学化学系，北京100084）

山楂为蔷薇科植物的果实，山楂果作为中药使用有着悠久的历史，具有消食健胃和**散瘀的功能^[1]。山楂（C. pinnatifida Bge.）果实中含有有机酸、黄酮、内酯、糖类、甙类等成分。已鉴别出的成分有酒石酸、柠檬酸、山楂酸、熊果酸、琥珀酸、丁烯二酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、枸橼酸、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素、槲皮素、胡萝卜苷、β-谷甾醇、芦丁等。芦丁(Rutin) 学名为芸香甙，又称维生素P，具有抗****脆性和异常的透过性作用，对紫外线有强的吸收作用，是目前较为理想的一种天然广谱防晒剂，临床上可用于**毛细管脆性引起的出血症并用作高血压的辅助**剂^[2]。

高效毛细管电泳具有高分离效率、分析时间短、进样量少、低检测限和良好的重现性。由于采用熔融石英毛细管，柱子不易污染和堵塞，而且仪器简单，且成本低，在中药分析中也已经有大量的文献报道。分析对象包括***中的各类物质(包括酸性、碱性和中性的物质) ，如有机酸、生物碱、黄酮及其甙类、香豆素类、氨基酸类、蛋白质类及皂甙等成分的分析^[3]。本文采用毛细管电泳紫外检测法测定了山楂中的芦丁，目前未见报道。

1.    实验部分

1.1    试剂与仪器

四硼酸钠（北京新光化学试剂厂，优级纯），十二烷基硫酸钠（SDS）（北京益利精细化学品有限公司，化学纯），三（羟甲基）氨基甲烷（Tris ）(北京益利精细化学品有限公司，分析纯)，磷酸二氢钠（北京益利精细化学品有限公司，分析纯），芦丁(Rutin) 对照品（北京化学试剂公司），试验用水为二次重蒸水。

CL2001高效毛细管电泳仪（北京彩陆科学仪器有限公司），紫外检测器（190-700nm），未涂层弹性石英毛细管柱（河北省永年锐沣色谱器件有限公司，内径75mm，总长58cm，有效长50cm）。

1.2    毛细管电泳条件

50mmol/L硼砂，40mmol/L十二烷基硫酸钠，pH为8.0。分离电压11kV，检测波长215nm，压差进样，进样高度7cm，进样时间8s。所有溶液使用前均用0.45μm 滤膜过滤，每次运行后依次以1 mol/L NaOH 溶液、蒸馏水及电泳缓冲液清洗毛细管5min，然后进行分离测定。

1.3    样品处理

山楂粉（天津双動堂药业有限公司，含20%山楂籽）1.0863g，15ml甲醇超声提取0.5h，过滤后未溶部分再用10ml甲醇超声提取0.5h，合并两次提取液，定容于25ml容量瓶中。

2.    结果与讨论

2.1    缓冲溶液种类对分离的影响

分别以含有80mmol/L十二烷基硫酸钠的20mmol/L硼砂溶液（pH8.0），含有80mmol/L十二烷基硫酸钠的20mmol/LTris（pH8.0），含有80mmol/L十二烷基硫酸钠的20mmol/L磷酸二氢钠（pH8.0）作为电泳缓冲液分离山楂提取物（pH8.0），发现80mmol/L十二烷基硫酸钠的20mmol/L硼砂溶液（pH8.0）作为电泳缓冲液的分离效果*好。

2.2  pH 值对分离的影响

为确定适宜的缓冲液pH 值，本试验考察了pH 值为7. 0 -11.0范围内含有80mmol/L十二烷基硫酸钠的20 mmol/ L 硼砂缓冲溶液对样品进行分离的情况。在碱性条件下更适合分离，因为在碱性溶液中硼酸盐会与芦丁分子中的邻二醇羟基形成配合阴离子而增加溶解度，减少了因吸附造成的峰拖尾等影响。在实验过程中发现，随着缓冲溶液pH 值的增大，峰电流增大，焦耳热增加。本实验选择缓冲液的pH 值为8.0 。

2.3  表面活性剂浓度对分离的影响

表面活性剂浓度下限不应低于临界胶束浓度的1.1倍，浓度太低，胶束稳定性差，负载小，分辨能力下降，重现性不好。浓度太高，电流变大，焦耳热增加，柱效降低。在pH 8.0 的20mmol/L 硼砂缓冲液中加入20，40，80，100 mmol/L的SDS，在同上条件下分离样品。当SDS 浓度为40 mmol/L 时分离效果*好。

2.4 缓冲液浓度对分离的影响

随着缓冲液浓度的增加，迁移时间延长，电流变大，焦耳热增加，分离效果降低。当浓度为20mmol /L时，分离不完全；而当浓度达到75 mmol/L时，电流过大。选定硼砂缓冲液的浓度以50 mmol/L。

2.5 分离电压对分离的影响

提高电压可以提高分离速度，在8 kV～11 kV 内样品分离的效果没有太大的差别。本实验综合考虑两组分的分离度、灵敏度、噪音、焦耳热及分析时间等因素，选择11 kV 为分离电压。

2.6 线性范围、精密度试验及样品测定

　　配制一系列芦丁对照品溶液，在确定的电泳条件下进行分离分析，芦丁的峰面积Y 与其质量浓度ρ(mg/ mL)在0.04mg/mL～1.0mg/mL范围内有良好的线性关系，线性回归方程分别为: Y = 702344ρ-27392 , r = 0.9991。

浓度为0.1mg/mL 的芦丁对照溶液各平行进样6 次，测得芦丁峰高的RSD 为1.3%，迁移时间的RSD为1.5%。

图1为样品溶液的毛细管电泳图，依上述实验条件平行6次测定芦丁的含量，测定结果为山楂提取液中含芦丁0.057 mg/mL，山楂粉中含芦丁1.32mg/g 。填加芦丁标准品于山楂提取物中进行加标回收试验的回收率为98-104%。