产品名称：黄曲霉**M1检测试剂盒

黄曲霉**M1检测试剂

RIDASCREEN? Aflatoxin M1

简介

RIDASCREEN?  Aflatoxin M1  30/15产品编号: （R1111）

采用竞争酶标**法定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉**M1。

试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔（包括标准试验）

如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。

（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）

样品制备

牛奶：脱脂

奶粉：还原、脱脂

奶酪：提取、离心

时间要求：（以10个样品为例）

牛奶/奶粉………………………….…….…….…大约0.5小时

奶酪………………………………….….………….大约2小时

孵育时间时间……………………….….………….大约1小时

检测下限

牛奶/奶粉：5ppt

奶酪：50ppt

回收率

牛奶：大约95％

奶粉：大约95％

奶酪：大约102％

交叉反应

黄曲霉**M1………………………………………….100％

黄曲霉**M2…..……………………………………….30％

1. 产品用途

RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15试剂盒利用竞争性酶**分析方法，用于定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉**M1。

2. 概述

黄曲霉**是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代谢产物，能致癌，高毒。

黄曲霉**M1是黄曲霉**B1的代谢产物。经摄入含有黄曲霉**B1饲料的奶牛产出的牛奶中，其中便含有黄曲霉**M1。由于黄曲霉**M1相当稳定，巴氏**法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉**M1不仅要在饲料原料中检测，而且在*终产品中也需要进行鉴定。自1999年一月开始，欧盟就制定了黄曲霉**残留的检测限，黄曲霉**M1的检测限为0.05 μg/l （50 ppt）。

使用RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15可以**定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉**M1。

3. 测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉**M1的特异性抗体。加入标准或样品溶液和在洗板后加入黄曲霉**酶标记物，游离黄曲霉**M1与黄曲霉**M1酶标记物竞争结合黄曲霉**M1抗体的结合位点（竞争性酶**分析方法）。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量，吸光值与样品中黄曲霉**M1浓度成反比。

4． 提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔）

盒中的材料如下：

1×96孔板（12条 X  8孔）包被有黄曲霉**M1抗体

6×黄曲霉**M1标准液，1.3 ml/瓶

浓度为：0 ppt， 5 ppt，10 ppt，20 ppt，40 ppt，80 ppt

黄曲霉**M1的牛奶缓冲液

1×酶标记物（1.3ml）……………………………….红色帽

过氧化物酶标记物的黄曲霉**M1

1×底物/发色剂（12ml）…………………………….. 蓝色帽

微红色，包含四甲基苯醌

1×反应停止液（14ml）...….…………………... ……黄色帽

为1N硫酸

1×缓冲液1（20ml）

样品稀释缓冲液

1×缓冲液2（12ml）...….…………………... …….…白色帽

酶标记物稀释缓冲液

1×洗涤缓冲液

为10Mm的磷酸缓冲液（pH7.4），包含0.05%的Tween20

5. 需要的材料但盒中不提供

5.1设备

－－－－微孔板酶标仪（450nm）

－－－－离心机

－－－－巴氏吸液管

－－－－刻度吸量管

－－－－50ul，100ul，400ul微量加样器

－－－－只用于奶酪检测

－－－－振荡器

－－－－蒸发器

5.2 试剂

－－－－甲醇

－－－－n-庚烷

－－－－二氯甲烷

－－－－PBS-缓冲液，pH 7.2：

0.55g  NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸馏水至1000ml

6.  操作者应该注意之事项

－－－－标准液含有黄曲霉**M1（致癌），要特别小心，应戴手套，避免试剂接触皮肤

－－－－使用过的玻璃容器*好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜

－－－－反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤

－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低

－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂

7.   储存条件

－－－－保存试剂盒于2-80C。不要冷冻

－－－－将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封

－－－－标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

－－－－无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

8．  试剂变质的迹象

发色试剂若显色表明发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

9． 样品处理

9.1. 牛奶

－－－－取牛奶样品，用冷冻离心机（3500g ，10℃）离心10分钟去除脂肪

（如没有冷冻离心机，可将样品先冷却到10℃，再离心）

－－－－离心后用巴氏吸液管彻底去除上层奶油。

－－－－取脱脂牛奶用于检测（每孔100μl）

9.2. 奶粉

－－－－用天平称取10g奶粉到容量瓶加去离子水到100ml。

（还原牛奶）

－－－－震荡5分钟，使充分溶解。

－－－－按照9.1牛奶样品处理步骤进行

9.3. 奶酪

代表性的样品应该研磨，充分混合。整个均质过程不要加入任何液体。

如果奶酪表面呈现出不同状态，则不要取奶酪表面作为样品，否则将影响检测结果。

－－－－称取2 g研磨过的奶酪，装入玻璃离心管中。

－－－－加入40ml二氯甲烷，放在振荡器上震荡15分钟。

－－－－过滤后取10ml滤液60 °C氮气吹干

－－－－将吹干残留的油状物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS缓冲液（参见5.2.）和1 ml庚烷充分混合溶解。

－－－－离心: 15分钟 / 2700 g / 15 °C 

－－－－完全除去上层庚烷层。

－－－－用巴氏移液管小心移取部分甲醇水层

－－－－取100 μl甲醇水层用400 μl缓冲液1稀释成为含10%甲醇的溶液

－－－－每孔用100 μl进行检测。 

备注:如果需要进一步稀释溶液，则使用缓冲液1进行稀释。

10.  酶标**分析程序

10.1测定之前注意事项

1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。 

3. 在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。

10.2 黄曲霉**M1酶标记物

Aflatoxin M1 酶标记物（红帽）为浓缩液。由于稀释了的酶标记物稳定性不好，因此只稀释需用量的酶标记物。稀释前酶标记物应轻轻振荡混匀。酶标记物用缓冲液2（白帽）以1: 11的比例稀释（400 μl浓缩液+ 4.0 ml 缓冲液，足够4个微孔板条32孔检测）

10.3 洗涤缓冲液

在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂，一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中，制备好的洗涤缓冲液在4oC条件下可以保存4周。

10.4 包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻。

10.5  测定程序  （在20-25 oC条件下操作）

1．将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。

2.  加入100ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育30分钟。

3．倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。

4．加入100ul酶标记物（红色帽）到微孔底部，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。

5．倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。

6．加入100ul底物/发色剂到微孔中，混合后在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。

7．加入100ul反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，15分钟内读取光度值。

11.  结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以**个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

────────────── × 100= %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个以黄曲霉**M1浓度（ng/l）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在10-40 ng/l （ppt）范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

为了得到样品中黄曲霉**M1的含量（ng/l），在标准曲线上读取的浓度必须乘以相应的稀释倍数。样品的稀释倍数如下：

牛奶/奶粉........................…………………….................1

奶酪....................................................……………….... 10

R-Biopharm开发出用于计算ELISA试剂盒检测结果的专用软件RIDA? SOFT，可以向当地分销商索取该软件。

12．  灵敏度

RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15试剂盒的*低检测下限为大约5 ppt，按照样品处理记录，牛奶、奶粉的检测限为5 ppt，奶酪的检测限为5 0ppt。

13． 特异性

RIDASCREEN?黄曲霉**M1 30/15试剂盒的特异性通过对相应的霉菌**交叉反应性分析而得到：

交叉反应：黄曲霉**M1....................................... 100 %

黄曲霉**M2.........……......................... 30 %

14．  再现性

由三个不同的实验结果确定了室内精密度，图2显示出RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉**M1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

15.  回收率

牛奶的回收率大约 95 % ，平均变异系数约14 %。

奶酪的回收率大约为102 % ，平均变异系数大约为11 %。