几年前,若提到microRNA(miRNA),大家可能还是一脸茫然,但现在它们却俨然生命科学世界的明星。这些RNA分子虽然很小(21-25 nt),容易被人忽略,却在基因表达的调控中扮演了重要的角色。我们所认识的miRNA也越来越多。*新版(14.0)的miRBase数据库中收录的microRNA序列信息**超过10,000条,其中人基因组中已鉴定出721条。成熟miRNA的表达是组织特异性的,miRNA的丰度可能相差几个数量级。更重要的是,miRNA表达的失调可能会引发癌症。因此,众多**研究实验室都争相绘制癌症的miRNA表达图谱,来了解miRNA的调控作用,并寻找癌症的标志物。
绘制miRNA图谱,芯片当然是优选。但miRNA在三个方面与mRNA不同:(1)miRNA是相当小的分子,丰度差异较大;(2) 成熟miRNA与其前体pre-miRNA和pri-miRNA共存,只是长度不同;(3)许多miRNA序列非常接近,比如同源分子,只有一个或几个核苷酸的差异。因此,常规芯片技术不能直接分析这些分子。目前市场上已经有不少miRNA芯片产品,但有些较繁琐,需要预分离microRNA,有些则缺乏分辨力,不能区分同源之间的差异。
现在,生物通带你了解一种新产品-美国Signosis公司的miRNAArray。我们之所以关注它,还是源于《Science》杂志的介绍。“基于T7-寡核苷酸连接分析的miRNA检测芯片,使用户用更少的花费去评估miRNA的表达。多种miRNA表达可通过一个简单的试验同时进行测定。该方法可**地鉴别只有一个核苷酸差异的同源miRNA,进而可区别出所有同源的miRNA。捕获的miRNA再进行T7扩增,不会出现PCR方法所导入的偏差。总RNA可以直接使用,无需预分离miRNA。”以上这段话译自2008年5月9日(Vol320)的《Science》杂志。
仔细琢磨一下,发现Signosis的芯片设计还真是有些巧妙。它融合了引物连接分析(oligo LigationAssay)和以T7转录为基础的线性扩增,开发出**的T7-OLA技术(图1)。对每一个miRNA分子,有二条引物(oligo)来识别,每条引物只识别miRNA一半的序列。其中的一条引物中含有Tag序列,另外一条引物含有T7启动子序列。只有序列完全匹配的时候,两个引物才能和miRNA杂交,形成RNA/DNA的杂合体。即使只有一个核苷酸不匹配,都会造成杂交或者随后连接的失败。这也是T7-OLA技术可分辨同源miRNA的原因。
由于miRNA分子太小,这个DNA/RNA杂合体可能不太稳定,因此引入了叠加序列。通过引物及互补序列的延伸,杂合体分子的稳定性增加。含有生物素(biotin,B)的短序列互补结合到其中的一条引物上。通过结合有亲和素(Streptavidin)的磁珠分离出杂合体。然后,两引物在T4连接酶的作用下,被连接成一条DNA片断。随后经过线性扩增(转录),含有生物素的UTP整合到RNA序列中。把转录好的RNA序列和预先准备好的含有不同miRNA序列的膜,进行杂交。*后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素进行反应,加入发光底物测定。
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图1. miRNA芯片分析的流程图。
虽然上面罗罗嗦嗦说了很多种oligo,但实际操作却相当简单,只有三步:(1)将总RNA或预分离的miRNA样品与提供的引物混合,形成RNA/DNA杂合体;(2)用磁珠选出杂合体,除去游离的寡核苷酸,在miRNA引导下两引物连接成一个DNA片断;(3)通过T7转录,扩增连接的DNA片断。之后就是杂交和检测了。目前Signosis公司提供多种miRNA芯片试剂,包括人、小鼠、大鼠、干细胞、肿瘤以及凋亡相关。人miRNA芯片试剂有60-72个点;肿瘤miRNA芯片试剂有132个点;小鼠miRNA芯片试剂有119个点;大鼠miRNA芯片试剂有113个点。据了解,更多功能方向的miRNA芯片以及检测更多miRNA的芯片正在研发中,这将促进miRNA芯片在探索miRNA差异表达方面的应用。
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近几年,研究人员大量绘制与癌症发生相关的miRNA表达图谱,希望从中找到诊断及**的线索。美国Wistar研究所的研究人员就鉴定出两种能够促进肿瘤扩散或转移的miRNA分子。其中一个miRNA分子还可能为乳腺癌转移的早期预防提供信息,并且有助于这种癌症的**。miRNA还可能是白血病的**靶标。另外,**丙型肝炎的头个miRNA**也已进入临床。如果你也在从事此类研究,相信miRNA表达图谱能帮你不少忙。
array分析是一种多重的分析,可以同时测定多个分子,但其结果需近一步确认,Northernblot是确认这些发现的*常用方法。此外,并非所有人都想绘制miRNA的表达图谱,有时我们只对某几个特别感兴趣。这时也可以用Northernblot。它简单易行,大部分实验室都可以操作。但Northern分析也有不少缺陷:很难鉴别同源miRNA,灵敏度不高,操作繁琐。
针对这些问题,Signosis开发出**的miRNA微孔板检测试剂。在miRNA微孔板检测中,一个miRNA分子通过二个连接oligo分别与捕获oligo、生物素化的检测oligo连接。杂交体通过与固相化的捕获oligo杂交固定在微孔板上,再由辣根酶标记链酶亲和素和发光底物检测,这种杂交体结构对miRNA分子序列非常敏感,即使一个核苷酸的差异也会阻止杂交体的形成,从而可分辨同源miRNA。而且该方法的敏感性也比Northernblot高。此外,这种微孔板检测非常简便,就像ELISA实验一样,只需加样、孵育、洗涤,而省去了繁琐的转膜和杂交。
![](http://y3.yzimgs.com/ComFolder/189984/downpic/2010316104041175.jpg)
图2.miRNA微孔板分析示意图。
另外,Signosis公司还提供了miRNA萤光素酶报告��体,靶基因报告载体,Northern blot分析试剂盒(http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=13)等产品,以供全方位的miRNA研究。
总结
基于T7-OLA**技术的miRNA芯片(http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=8)具有以下优点:
? 分辨力强---能分辨所有同源的miRNA ,所有同源的let7可清楚分辨;可分辨前体miRNA和成熟miRNA
? 线性扩增---捕获的miRNAs被T7转录扩增,没有PCR扩增引入的偏差
? 勿需预纯化---总RNA可以直接进行分析,勿需预分离
? 操作简单---步骤简单、流畅
miRNA微孔板检测试剂(http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=93)具有以下优点:
? 操作简单---做miRNA试验就像做ELISA试验,无需用酶转换miRNA成cDNA,检测步骤只是孵育和洗涤。
? 灵敏度高---较miRNA Northern blot分析敏感1000倍。
? 分辨力强---在分辨同源miRNA 时,较Northern blot有更高的分辨力。
? 差别定量---二个或二个以上特定miRNA表达的差异可定量分析。