几年前，若提到microRNA（miRNA），大家可能还是一脸茫然，但现在它们却俨然生命科学世界的明星。这些RNA分子虽然很小（21-25 nt），容易被人忽略，却在基因表达的调控中扮演了重要的角色。我们所认识的miRNA也越来越多。*新版（14.0）的miRBase数据库中收录的microRNA序列信息**超过10,000条，其中人基因组中已鉴定出721条。成熟miRNA的表达是组织特异性的，miRNA的丰度可能相差几个数量级。更重要的是，miRNA表达的失调可能会引发癌症。因此，众多**研究实验室都争相绘制癌症的miRNA表达图谱，来了解miRNA的调控作用，并寻找癌症的标志物。
绘制miRNA图谱，芯片当然是优选。但miRNA在三个方面与mRNA不同：(1)miRNA是相当小的分子，丰度差异较大；(2) 成熟miRNA与其前体pre-miRNA和pri-miRNA共存，只是长度不同；(3)许多miRNA序列非常接近，比如同源分子，只有一个或几个核苷酸的差异。因此，常规芯片技术不能直接分析这些分子。目前市场上已经有不少miRNA芯片产品，但有些较繁琐，需要预分离microRNA，有些则缺乏分辨力，不能区分同源之间的差异。
现在，生物通带你了解一种新产品-美国Signosis公司的miRNAArray。我们之所以关注它，还是源于《Science》杂志的介绍。“基于T7-寡核苷酸连接分析的miRNA检测芯片，使用户用更少的花费去评估miRNA的表达。多种miRNA表达可通过一个简单的试验同时进行测定。该方法可**地鉴别只有一个核苷酸差异的同源miRNA，进而可区别出所有同源的miRNA。捕获的miRNA再进行T7扩增，不会出现PCR方法所导入的偏差。总RNA可以直接使用，无需预分离miRNA。”以上这段话译自2008年5月9日（Vol320）的《Science》杂志。
仔细琢磨一下，发现Signosis的芯片设计还真是有些巧妙。它融合了引物连接分析（oligo LigationAssay）和以T7转录为基础的线性扩增，开发出**的T7-OLA技术（图1）。对每一个miRNA分子，有二条引物（oligo）来识别，每条引物只识别miRNA一半的序列。其中的一条引物中含有Tag序列，另外一条引物含有T7启动子序列。只有序列完全匹配的时候，两个引物才能和miRNA杂交，形成RNA/DNA的杂合体。即使只有一个核苷酸不匹配，都会造成杂交或者随后连接的失败。这也是T7-OLA技术可分辨同源miRNA的原因。
由于miRNA分子太小，这个DNA/RNA杂合体可能不太稳定，因此引入了叠加序列。通过引物及互补序列的延伸，杂合体分子的稳定性增加。含有生物素（biotin，B）的短序列互补结合到其中的一条引物上。通过结合有亲和素（Streptavidin）的磁珠分离出杂合体。然后，两引物在T4连接酶的作用下，被连接成一条DNA片断。随后经过线性扩增（转录），含有生物素的UTP整合到RNA序列中。把转录好的RNA序列和预先准备好的含有不同miRNA序列的膜，进行杂交。*后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素进行反应，加入发光底物测定。
图1. miRNA芯片分析的流程图。
虽然上面罗罗嗦嗦说了很多种oligo，但实际操作却相当简单，只有三步：(1)将总RNA或预分离的miRNA样品与提供的引物混合，形成RNA/DNA杂合体；(2)用磁珠选出杂合体，除去游离的寡核苷酸，在miRNA引导下两引物连接成一个DNA片断；(3)通过T7转录，扩增连接的DNA片断。之后就是杂交和检测了。目前Signosis公司提供多种miRNA芯片试剂，包括人、小鼠、大鼠、干细胞、肿瘤以及凋亡相关。人miRNA芯片试剂有60-72个点；肿瘤miRNA芯片试剂有132个点；小鼠miRNA芯片试剂有119个点；大鼠miRNA芯片试剂有113个点。据了解，更多功能方向的miRNA芯片以及检测更多miRNA的芯片正在研发中，这将促进miRNA芯片在探索miRNA差异表达方面的应用。
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近几年，研究人员大量绘制与癌症发生相关的miRNA表达图谱，希望从中找到诊断及**的线索。美国Wistar研究所的研究人员就鉴定出两种能够促进肿瘤扩散或转移的miRNA分子。其中一个miRNA分子还可能为乳腺癌转移的早期预防提供信息，并且有助于这种癌症的**。miRNA还可能是白血病的**靶标。另外，**丙型肝炎的头个miRNA**也已进入临床。如果你也在从事此类研究，相信miRNA表达图谱能帮你不少忙。
array分析是一种多重的分析，可以同时测定多个分子，但其结果需近一步确认，Northernblot是确认这些发现的*常用方法。此外，并非所有人都想绘制miRNA的表达图谱，有时我们只对某几个特别感兴趣。这时也可以用Northernblot。它简单易行，大部分实验室都可以操作。但Northern分析也有不少缺陷：很难鉴别同源miRNA，灵敏度不高，操作繁琐。
针对这些问题，Signosis开发出**的miRNA微孔板检测试剂。在miRNA微孔板检测中，一个miRNA分子通过二个连接oligo分别与捕获oligo、生物素化的检测oligo连接。杂交体通过与固相化的捕获oligo杂交固定在微孔板上，再由辣根酶标记链酶亲和素和发光底物检测，这种杂交体结构对miRNA分子序列非常敏感，即使一个核苷酸的差异也会阻止杂交体的形成，从而可分辨同源miRNA。而且该方法的敏感性也比Northernblot高。此外，这种微孔板检测非常简便，就像ELISA实验一样，只需加样、孵育、洗涤，而省去了繁琐的转膜和杂交。
图2.miRNA微孔板分析示意图。
另外，Signosis公司还提供了miRNA萤光素酶报告载体，靶基因报告载体，Northern blot分析试剂盒（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=13）等产品，以供全方位的miRNA研究。
总结
基于T7-OLA**技术的miRNA芯片（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=8）具有以下优点：
? 分辨力强---能分辨所有同源的miRNA ，所有同源的let7可清楚分辨；可分辨前体miRNA和成熟miRNA
? 线性扩增---捕获的miRNAs被T7转录扩增，没有PCR扩增引入的偏差
? 勿需预纯化---总RNA可以直接进行分析，勿需预分离
? 操作简单---步骤简单、流畅
miRNA微孔板检测试剂（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=93）具有以下优点：
? 操作简单---做miRNA试验就像做ELISA试验，无需用酶转换miRNA成cDNA，检测步骤只是孵育和洗涤。
? 灵敏度高---较miRNA Northern blot分析敏感1000倍。
? 分辨力强---在分辨同源miRNA 时，较Northern blot有更高的分辨力。
? 差别定量---二个或二个以上特定miRNA表达的差异可定量分析。