根据卫生部2008年发布的调查报告，恶性肿瘤已成为我国城市的首位死因，且我国恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平。如何擒拿这个“头号杀手”？这给肿瘤学的研究人员布置了一道难题。好在，我们有很多工具可以利用，比如近来渐趋流行的高内涵分析。肿瘤学研究很容易采用高内涵分析，因为它与多个高内涵的应用直接相关。例如，任一种癌症**的主要目标都是杀死癌细胞，那么也就离不开细胞毒性、细胞增殖与凋亡等分析。传统的分析工具包括流式细胞仪和显微镜成像系统，然而，激光扫描微孔板细胞仪却有着更多的优势。
就拿肿瘤学中常见的细胞周期分析来举个例子。TTPLabTech公司出品的AcumeneX3高通量化高内涵筛选平台有着流式细胞仪无法比拟的通量。整个384孔板的读取只需要10分钟，这其中还包括了多重分析，比如有丝分裂指数的确定。流式细胞仪只能分析细胞悬液，而AcumeneX3则能够在原位分析贴壁细胞，保留了细胞在处理过程中所发生的形态变化。光这两点就已经很有吸引力了，当然，Acumen的应用也不仅是细胞周期分析，还包括肿瘤学研究中的多个应用，如蛋白激酶图谱分析、细胞增殖、克隆形成、细胞毒性、凋亡、细胞粘附、血管生成等等。本文就详细描述了Acumen在几个关键领域的应用。
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2. 蛋白激酶图谱分析
蛋白激酶在许多信号通路如增殖、分化和凋亡中起了重要的调节作用。目前已鉴定的人类激酶有518种，这表示我们有很大的机会去发现新的激酶通路。过去，研究激酶通路常采用体外分析法，也就是利用放射性标记的ATP来检测结合事件。这些方法非常灵敏，但局限于通量低，且使用不讨人喜欢的同位素。另一个问题就是蛋白从体内分离出来后，它起作用的方式可能会改变。反应中可能会缺少了某些对整个细胞功能很关键的成分，比如支架蛋白（scaffoldprotein）。
研究显示，支架蛋白将激酶通路中各个组分拉到一块，从而实现了特异的细胞内相互作用。（如图2.1）。JIP-1（JNK相互作用蛋白-1）就是这样一种哺乳动物的支架蛋白，它是MLK、MKK7和JNK特异的，能促进这些酶的活化。在全细胞的环境中，通路激活所需的所有成分都是以天然的数量存在，自然也就排除了理论配比失衡。利用全细胞分析，就有可能鉴定出在接头蛋白位点起作用的化合物，从而有助于新药的开发。
图2.1JIP-1充当支架蛋白，将MLK、MKK7和JNK拉到一起。
A．接头蛋白未受刺激，激酶就不能停靠，因此不足以局部化形成激酶级联。
B．一旦支架蛋白激活，就发生构象改变，允许激酶级联的组分结合到接头蛋白上，让它们足够接近并激活。
在大多数化合物都被排除之后，基于细胞的高内涵分析广泛应用于**轮的激酶活性图谱分析。由于现有技术的低通量，它们在高通量筛选中的应用面临巨大的挑战。对于高内涵激酶分析而言，也有一个额外的难题，那就是**检测所需的固定步骤有很多步，非常耗时。
激光扫描高通量化高内涵筛选平台，如AcumeneX3，将CCD成像仪的目标识别能力与荧光读板机的快速读取能力相结合,从而突破性地把对细胞水平的筛选应用到初筛领域，如蛋白激酶及它们对细胞周期调控的初筛（图2.2、图2.3）。此外，利用激酶的抗体或GFP标签蛋白还能直接定量激酶活化所产生的蛋白转位（图2.4、图2.5）。而Acumen对细胞数量的要求也不高，每孔中1000-2000个细胞均可，降低了对细胞培养的要求。
图2.2CHO细胞暴露在茴香霉素中5分钟，然后固定。利用抗磷酸化-p44/42MAP激酶抗体和羊抗兔TIFC二抗来检测ERK的激活。左为对照细胞，右为处理细胞。上图FITC只显示出活化的细胞，下图Syto64显示出总细胞数。
图2.3CHO细胞暴露在茴香霉素中35分钟，然后固定。利用抗磷酸化-p54 JNK抗体和羊抗兔TIFC二抗来检测JNK的激活。EC50 =450 nM
图2.4 NFkB蛋白转运分析。使用Alexa Fluor 488标记的NFkB抗体检测，使用PI对细胞核进行染色。
图2.5 AcumeneX3软件显示GFP偶联的蛋白激酶在细胞质与细胞核之间的转运。A. 对照；B. 激活。
AcumeneX3的全孔扫描能力能够在高通量的前提下对每个孔中的每个细胞进行高内涵分析。这种对全体细胞进行分析的模式（而非像其它仪器的每孔取点采样分析模式）对于激酶图谱分析来说益处良多。首先，综合所有细胞，可以它能够克服**染色后细胞随机分布的问题，产生统计学上可靠的数据；其次，全孔扫描还能够可以得出全体细胞数，计算出生物反应对细胞总数的比例，从而实现归一化分析，故可以算出所测定细胞生物反应在全体细胞中百分比从而实现数据的均一化分析每个细胞生物反应的标准化，对每次检测可以非常方便地得出给出一个简单的毒性或增殖的读数。而AcumeneX3仪器的多道激光（405nm，488nm和633nm）和多通道检测（每道激光*高四通道同时检测，这意味着理论上可进行12通道色实验）进一步扩大了荧光探针和蛋白的范围，让激酶图谱分析也能多��化。
3. 细胞周期分析
细胞周期代表了真核细胞中*基本也是*重要的过程之一。此过程被细胞质中的蛋白严格调控，主要是细胞周期蛋白（cyclin）和cyclin依赖的激酶，让细胞有序地从G1、S、G2一直发展到M期。细胞周期调控的缺陷是肿瘤细胞的典型特征，在癌症中经常会发现参与细胞周期调控的基因发生了突变。这也为开发****的新靶点提供了很好的机会。因此，研究人员对细胞周期调控异常的兴趣日益增长。
不断加速**开发进程的迫切要求催生了多种高通量筛选技术。这也让通过初筛的化合物数量显著增加，而在某些研究领域复筛成了瓶颈，因为复筛由于当时技术和设备的限制只能应用低通量的分析。细胞周期分析就是其中一个。传统的方法是利用流式细胞仪来定量细胞中总的DNA含量。DNA含量的测定是流式细胞仪*早的应用之一，至今仍是*普遍的应用之一。这要归因于流式细胞仪固有的高灵敏度，以及科研和临床应用中有那么多久经考验的操作方法。然而对于筛选来说，流式细胞仪并不**。因为它通量低，需要大量细胞，而且不能在原位分析贴壁细胞系，需要重悬细胞，耗时费力。
传统的方法是用荧光染料对固定细胞的核进行染色，来测量DNA含量的变化。随后，流式细胞仪根据荧光强度将细胞分为G1、S和G2/M期。由于G2和M期的细胞有着相同的DNA含量，因此光凭DNA染色不能分辨它们。*常用的染料是碘化丙啶（PI），它插入DNA双螺旋，并发出强烈的红色荧光。它是由488nm的光激发，因而适用于大部分流式和微孔板细胞仪。PI不能渗透完整的细胞膜，因此细胞在一开始就必须经过透化处理。PI还会对双链RNA进行染色，这样还需要用到RNase。
基于以上的种种不便，TTPLabTech开发出一种全新的利用AcumeneX3的细胞周期分析方法，能够在10分钟以内读取整个96、384、1536孔板（Acumen特有的按面积扫描模式使得96，384与1536孔的扫描时间基本相同）。这种方法的另一个*主要优势是能够在原位分析贴壁细胞，而不像流式细胞仪那样需要将细胞悬浮。原位读板保留了**处理过程中可能发生的形态改变，还能够分析外形，并确定细胞核的定位。这些信息能看见有丝分裂晚期的多个细胞核，将G2期的细胞分辨出来。此外，它还能进行细胞周期和有丝分裂指数的多重测定。固定细胞用PI和抗磷酸化组蛋白H3的抗体染色后，利用488nm的光激发，能同时分析两种参数（图3.1）。
图3.1固定细胞用PI（细胞周期分析）和抗磷酸化组蛋白H3（FITC结合，有丝分裂指数）染色，两个分析在AcumeneX3上同时进行。
激光扫描的优势在于它能产生荧光物体的三维模型，包括细胞核。研究人员已经开发出数学模型，从单个的DNA柱状图来计算细胞周期中不同时期的细胞比例（图3.2）。对于筛选应用，AcumeneX3的通量是无可比拟的，它几个小时就能完成流式细胞仪一个星期才能做完的工作。所有的细胞处理都是在微孔板中进行，因此也很容易上升到自动化。曾有报道指出，利用AcumeneX3高通量化高内涵筛选平台**能筛选300000个化合物。因此，它也非常适合于基因组范围的RNAi图谱分析。今后，TTP将会开发多重细胞周期分析的验证步骤，将常规的周期分析与有丝分裂指数和蛋白转位分析结合起来，而后者已经超出了流式细胞仪的能力范围。
图3.2HeLa细胞（每孔2,000个细胞）原位标记用于细胞周期检测。A, PI染色（10 uM）； B, Hoechst34580染色（10 uM）；C, Vybrant DyeCycleTM Orange染色（5 uM）；D, TO-PRO-3染色（0.5 uM）。 在一台Acumen eX3上分别使用405, 488 and 633nm激光激发。
4. 细胞克隆形成
作为细胞毒性的参数，细胞克隆形成被认为比细胞活力更为灵敏，因为克隆形成是在细胞处于增殖状态时评估的，所以更易受毒性作用的影响。过去，克隆计数是在半固体的琼脂糖双层系统上进行的，还要在显微镜下一个一个地数。当然，这其中就会有主观因素的影响。后来，出现了更**的图像分析系统，但是由于它的景深有限，不能准确分辨大体积的克隆；而且它的成像面积较小，通常为1mm×1 mm，因而不能对全孔进行克隆计数；*后由于需要多点成像，导致检测速度很慢。
现在，研究人员转而利用AcumeneX3来确定细胞生长抑制剂-星形孢菌素对HT1080细胞克隆形成的影响。AcumeneX3能够自动地对24或96孔板进行高内涵的全孔扫描。它的软件应用体积算法来确定克隆数量。这种算法利用扫描目标之间的*大和*小距离来估计细胞的体积。研究表明体积更能代表体内细胞克隆的形成，因为它与肿瘤生长的相关性更好。