生物标志物（Biomarker）是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或**过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。 检查一种**特异性的生物标志物，对于**的鉴定、早期诊断及预防、**过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标记物已经成为目前研究的一个重要热点， DNA，RNA，蛋白质，小分子多肽，糖类作为分子标记物已经大量用于基础和**诊断研究和应用，基于多肽和蛋白质生物标记物的蛋白组表达模式诊断是一种很有前景的**早期检测。
ThermoScientific联合马赛诸赛州综合医院建立了Biomarker Research Initiative in MassSpectrometry(BRIMS)中心，该中心建立了基于磁珠的色谱分离技术研究血清中的分子标记，以一种简单、有效和可重复的方式每天处理上百的样品。采用基于疏水相互作用的反相RPC磁珠（ReversePhase Chromatography，DynabeadsRPC18）可以从血浆样品中结合多肽片段，经乙氰洗脱，获得高质量的肽段表达谱。通过比较不同条件下肽段表达图谱的差异，以寻找潜在的可能血浆生物标志物。
本文介绍BRIMS中心基于全自动磁珠的色谱分离技术从人血浆中分离鉴定内生多肽谱标记物的研究，发展一种自动化、基于vMALDI技术和计算软件的从人血浆中内生肽差异分析。
前言
近十年来，对生物标记物的兴趣经历爆发性的过程，越来越多的研究开始关注多肽组质谱图特征性的变化作为不同**变化指示剂在医疗方面的潜在应用。在人血浆多肽组中含有约5000个独特的肽段。开发一种能准确鉴定多肽组中相关成分的强大的方法势在必行，不仅可以加快对**生物学状态的了解，也加强开发这些**生物标记的能力。
方法和流程（见图1）
①基于磁珠的样本制备；②vMALDI质谱采集；③数据库检测和软件分析。其中KingFisher96磁珠纯化系统参与血浆中多肽样品的制备。通过疏水反向RPC磁珠，选择性的分离和富集人血浆中发现的内生多肽。经过vMALDI质谱采集以及一种新的差异表达分析的软件（BioSieve?），该软件能自动鉴定经vMALDIMS质谱检测的、在统计学上具备明显变化相关信号强度的变化。这种结合和检测多肽水平变化的方法，可以**检测加有6种人工合成多肽标准品的人血浆样品。
图1：（A）工作流程，（B）常规质量范围（700-2000m/z）和(C)高质量范围（2000-4000m/z）vMALDI人血浆质谱图，血浆经疏水相互作用的反相RPC磁珠富集，星号标记的是加入的多肽标准品。
实验过程和结果
一、样品自动化准备
为了模拟在人血浆中的时间流程试验，血管紧缩素I（Angiotensin I），纤连蛋白片段（ fibronectinfragment）（1377-1388），蛙皮素（bombesin），ACTH片段（18-39）胰血糖素（glucagon）和氧化的胰岛素B链（oxidized insulin B chain）（Sigma, St. Louis,MO）等6种多肽标准品按以下不同浓度被加入到解冻的人血浆中：两个多肽浓度按2倍递减，【Angiotensin I(640-20fmol/μL), glucagon (64 -.2pmol/μL)】, 两个多肽浓度按2倍递增【fibronectin(30-960fmol/μL), ACTH (80-2560fmol/μL)】，两个多肽浓度固定 【bombesin(300fmol/μL)， Insulin B chain oxidized(1600fmol/μL)】，产生6种不同的血浆样本。将加有多肽的血浆样品置于冰上直至分层。将所有6种经处理的样品各取25ul加到96孔板中，并设置未加多肽标准品的血浆作为阴性对照，含血浆样品的96孔板放入KingFisher96磁珠分离系统进行处理，通过**的磁珠转移技术，将磁珠从一个孔收集后转移到另一个孔，再释放磁珠，自动富集血浆中的内生多肽和多肽标准品。在磁珠分离富集过程中，每个样品孔中加入50ul反相RPC磁珠，结合2分钟后，吸取磁珠，转移到洗涤液中，共洗涤三次，每次30秒钟。洗涤后洗脱磁珠上的多肽片段，洗脱液为25ul含0.1%甲酸的50%乙腈溶液中，并将磁珠转移，得到富集的血浆多肽溶液。得到的样品可以直接点样到vMALDI板上，通过Finnigan?LTQ? linear ion trap fitted with a vMALDI?source和Finnigan TSQ Quantum ? HR triple quadrupole MS (ThermoScientific, San Jose, CA)进行快速LC-SRM分析。
样品自动化准备：KingFisher磁珠纯化和富集人血浆多肽及检测流程图
二、软件的数据处理分析
通过磁珠纯化富集，在人血浆中加入6中人工多肽标志物，其中ACTH (80-2560fmol/μL)按2X递增, glucagon(64 -.2pmol/μL)按2X递减，Insulin B chain oxidized(1600fmol/μL)浓度保持不变，产生6种不同的血浆样本检测水平（见图1）。每种水平的样品点样11次，产生66个质谱数据。vMALDIMS的数据收集起来通过BioSieve?分析，自动从多重LC/MS样品套数据中分析MS图谱相关变化，结果见图2和图3。
总结
- 采用基于疏水相互作用的反相RPC磁珠和KingFisher96全自动磁珠纯化系统的自动化样品处理过程，可以从血浆样品中可重��的富集多肽片段，这种富集方法保留了相关的丰富的信息，完全满足高通量差异分析的需求。
- 可以**鉴定和检测一个单一扫描样品在统计学上的显著变化，检测范围达到25-50fmol每个样品点的水平，这个变化来自于在一系列标准品加入到一个复杂的混合物中（通过磁珠富集血浆中的多肽）的反应。
- 通过这个平台，可以进行差异和趋势分析，以追踪单个多肽在复杂混合物中的水平改变。
结论
生物标记物的研究和开发，尤其是与人类**相关的标记物的研究，已经成为热点。在多肽和蛋白质的标记物研究过程中，样品的前处理成为一个很重要的环节，磁珠富集法已经成为蛋白质组表达谱研究中制备样品的强有力工具，适合血清、血浆、尿液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液、组织提取物和各种分泌物等样本。ThermoScientific的KingFisher磁珠纯化系统，以****的磁珠分离技术，在不同的纯化阶段——磁珠与样品结合、清洗以及目标物洗脱等过程中采用磁棒通过磁珠转移纯化对象，避免了液体处理过程，提高了自动化程度，使之成为一种可靠和强大的分离纯化技术；可以从各种来源的材料如全血，细胞培养液，组织裂解液，土壤，排泄物等中间提取纯化目标分子，包括DNA,RNA,蛋白质，多肽片段，细胞等。
KingFisher磁珠纯化系统提供一个开放的平台，所有商业化的磁珠如表面标记疏水、亲水、阳离子、阴离子、弱阳离子、弱阴离子、金属离子鳌合（如Cu、Fe）、带有ConA和蛋白G的磁珠都可以在该仪器上运行，自动富集多肽片段，以满足高通量多肽和蛋白质生物标记物研究的样品制备。ThermoScientific为生物标志物的开发提供从样品处理，分离，鉴定等一系列研究仪器和相关分析软件的整体解决方案，包括离心机，移液器，磁珠纯化系统，样品处理耗材，质谱及分析软件等。
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参考文献：
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