这几年来,你的表达载体是不是一直没更新过?那可有些跟不上潮流,生命科学领域发展迅猛,在microRNA、干细胞、RNAi等领域每天都有新发现。因此,基因表达的工具也变得更加多样化和专业化。是时候升级你的表达载体啦。许多表达载体简化了亚克隆或PCR等耗时的步骤,同时增加了一些增强子,提高了蛋白产量。在选择表达载体时*重要的考虑因素当然是你的宿主系统。检测方法同样是需要考虑的。现在市场上的大部分载体都具有6×His或GFP标签,能轻松鉴定和纯化表达产物。然而,任何标签都有可能干扰你的蛋白功能。因此,*近几年无标记的检测技术开始大热,你是不是也想尝试一下“裸蛋白”?本文介绍了一些*新的表达载体,希望其中有你想要的。
Profinity eXact表达载体Bio-Rad
ProfinityeXact融合标签系统将亲和层析纯化和标签的去除整合成一步,解决了标签去除过程的技术瓶颈。它将目的蛋白克隆至ProfinityeXact pPAL7表达载体上Profinity eXact 标签的下游,从而产生了N端带有标签的重组蛋白。固定在Profinity eXact纯化介质上的丝氨酸蛋白酶突变体选择性地与Profinity eXact标签结合。通过结合后的清洗过程去除宿主细胞的杂质,然后加入F-或N3-**地诱发了亲和标签与目的蛋白之间的酶切,从而导致ProfinityeXact 标签被固定的蛋白酶滞留在介质上,仅重组蛋白从层析柱上洗脱,无需其它处理即可将其进行下游应用。
pcDNA3.3-TOPO载体Invitrogen(LifeTechnologies)
pcDNA系列的升级版。此载体利用CMV启动子/增强子的组合在大多数哺乳动物细胞中实现高水平表达。它可以瞬时转染贴壁细胞,也可与悬浮的FreeStyleMAX系列结合,大量表达native蛋白。克隆方式是TOPO,很快很省心。
pAdVAntage? Vector Promega
将pAdVAntage载体与您的载体共转染,能在多种细胞中增加蛋白的表达量。转染中产生的双链RNA会激活dsRNA-activatedinhibitor(DAI),一种宿主细胞抗病毒防御系统中的酶。DAI将转录起始因子eIF-2磷酸化,终止翻译和蛋白合成。然而,在共转染pAdVAntage载体后,RNA聚合酶III产生的腺病毒VAIRNA能克服DAI的转录抑制。VAIRNA与DAI结合,防止其激活,实现翻译和蛋白表达。在293和Hela细胞中,pAdVAntage载体与荧光素酶载体的共转染能将荧光素酶的表达量至少提高10倍。