新的MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸试剂盒-兼顾快速和高产率的全新解决方案

Michael Kirchgesser*, Agnes Aschenbrenner, Irene Huber, Sarah Müller, Heike Girgnhuber, Hubert Schuldlos, Anna Werner, Werner Malmberg, Robert Steiner, Martin Victor, Thomas Kirschbaum, Claudia Kappelsberger, Michael Knoll, and Peter Wenzig

德国匹茨堡，罗氏应用科学部
*通讯作者： michael.kirchgesser@roche.com

前言
MagNA Pure96是*近进入市场的一种全新仪器：它是一种全自动、超高速的系统，它能用于将高质量核酸从各种样品类型中高速分离，1小时以内即可完成多至96个样本的自动纯化，处理的样品容量*高达到1ml。该系统采用装有预装式即用型试剂的优化试剂盒，并配有相应的自动分离方法。这种试剂盒的配置基于沿用已久的磁珠技术，后者成功用于不同的MagNAPure系统已有多年。MagNA Pure 96试剂盒由配有不同预装式密封缓冲液容器的试剂盘和含磁粉的专用瓶组成。

可提供的所有试剂盒都有小容量（SV）和大容量（LV）的不同规格，可根据要处理的样品量决定。 本文描述了2种MagNA Pure96 DNA和病毒核酸试剂盒及其方法的特征和性能。 

材料和方法
新的试剂盒及方法是用人EDTA血浆、枸橼酸盐血浆、血清和全血以及培养细胞（K562和HeLa）作为样品材料开发和测试的。

全血不需要经过预处理即可用于基因组DNA分离。培养细胞小球在使用前要悬浮于PBS中。

在病毒核酸分离时，使用前在样品中添加不同量的DNA病毒（巨细胞病毒、EB病毒、细小病毒B19）和RNA病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感病毒）。然后用移液管将样品移入MagNAPure 96仪器上的MagNA Pure 96处理盒中。所有样品至少以8倍复制进行试验。根据实验需要，纯化核酸的洗脱体积被设定为50μl、100μl或200μl。在LightCycler?480仪器上采用吸光度（OD）测定、琼脂糖凝胶电泳和/或参数特定的定量实时PCR和RT-PCR分析对洗脱液进行分析。采用15μl各自混合母液和5μl各自洗脱液建立扩增反应，运行45个循环。

结果和讨论

一般特征
试剂盒的组成：排列在试剂盘中的预装式试剂容器，便于加载；分开放置、含磁珠（MGP）悬液的瓶子（图1）。试剂盘和瓶子都在运行前放入仪器抽屉中各自的位置。使用后容器可以方便地重新密封，并保存以待必要时进行后续的运行。MGP瓶具有特殊的瓶盖，可以在仪器的针穿过后自动重新密封。所有组件在室温下都能保持稳定。

MagNA Pure 96DNA和病毒核酸小容量规格用于从200μl全血，或从5×105个培养细胞中分离基因组DNA。它还可以从200μl血浆、血清或全血中分离病毒DNA或RNA。试剂盒包括3个预装式试剂容器，每个容器*多可进行192次反应（即每个试剂盒进行576次纯化）。

图1：试剂盒组件。
试剂盒、试剂盘、磁珠瓶。   

MagNA Pure 96DNA和病毒核酸试剂盒大容量规格用于从500μl或1000μl全血或从10⁶个培养细胞中分离基因组DNA。它能从500μl血浆、血清或全血，或从1000μl血浆或血清中分离病毒DNA或RNA。试剂盒包括3个预装式试剂容器，每个容器*多可进行96次反应（500μl）或48次反应（1000μl）（即每个试剂盒分别进行288或144次纯化）。

如果需要的话，试剂盒可用于不同的优化方法，包括外部溶解方法可供选用，从而允许在MagNA Pure 96仪器外进行病毒灭活。对于所有方法，核酸从不同容量的样品中都可以方便地洗脱，样品的不同容量可以由用户选择。

基因组DNA
基因组DNA的分离及其后续分析显示可重复性、产量、完整度和纯度都很高。根据琼脂糖凝胶分析，DNA片段平均显著大于20kb（图2）。

表1总结了典型的DNA产率和纯度。请注意产率显著依赖于血细胞数，因此变化可能达到2倍。

如LightCycler?480仪器中进行的PCR之前的稀释实验所示（数据未显示），DNA也被证明不含PCR抑制剂。

用不同量的血液与样品检测了该程序的可量测性。结果见图3。

病毒核酸

线性范围
达到了纯化病毒DNA和RNA的高产率。从较宽的浓度范围分离病毒核酸是可能的（图4）。
 

图2： 对血液中分离的DNA的琼脂糖凝胶（显示20个复本）。 在21kb位置的DNA带显示了分离DNA的高完整度。 （M=分子量标记III）
 

图3： 可量测性。从不同量血液中分离的DNA的琼脂糖凝胶分析显示纯化法的可量测性良好。
 

图4： 线性范围。每份样品中加样浓度为10-106拷贝的Epstein-Barr病毒（EBV）DNA和甲型肝炎病毒RNA的分离。
 
内部质控和可重复性
MagNA Pure 96系统能在每次分离反应中都包括一次内部质控（IC）。 IC从机载IC管中自动移入每个孔中的溶解缓冲液中。在一次纯化操作的所有96��孔中，采用稀释的细小病毒B19质粒作为IC，阴性血清作为样品材料来检查该功能。IC的分离具有很高的可重复性（图5）。

交叉污染试验
进行这些试验是为了考查MagNA Pure 96仪器上可能孔间污染的程度。细小病毒B19被选作这些试验的敏感参数；检测极限大约为每次PCR 2.5个拷贝。然后以5×107拷贝/ml（=检测极限以上106倍）向血浆加样，用大容量方法（500μl样品）和50μl洗脱体积在MagNA Pure96仪器处理。

进行3次“棋盘式”运行（每次有48份阳性加样血浆样品和48份阴性未加样血浆样品排列成棋盘状）。 在LightCycler?480仪器上对洗脱液进行分析。 在这些条件下未发现交叉污染（图6）。

图5： 内部质控品。从所处理样品盒的所有96个孔中分离出的细小病毒B19内部质控品的PCR分析。 
  

图6： 交叉污染试验。48份阳性和48份阴性样品排列成棋盘状，经过处理，进行交叉污染分析。所有阴性样品鉴定结果均为“阴性”，而所有阳性样品和所有质控品都显示了预期的信号。该试验重复了3次，均得到相同的结果。

“血浆用”和“通用”方法
在方法优化期间发现，有些样品材料（即：血清、全血和枸橼酸盐血浆）在与“标准”材料EDTA血浆不同的工作流程下能得到更好的结果。因此，在“血浆用操作方法”之外，还提供另一种“通用操作方法”，后者能使这些样品类型得到更好的结果（达到5个交叉阈值）。选用“通用操作方法”这个名称是因为这些方法对于血清、全血和枸橼酸盐血浆，优于“血浆用操作方法”；而对于EDTA血浆，至少对所检测的病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感、EB病毒、巨细胞病毒）是与“血浆用操作方法”相等的。由于结果可能随个别实验设备和所检测参数的不同而变化，因此在仪器的方法菜单中提供不同的方法供选择，使用户能选择对实际应用的*佳解决方案。

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结论
新的MagNA Pure96DNA和病毒核酸试剂盒能从多种样品材料中全自动高效分离DNA和病毒核酸，具有高速和高产率。用户可以根据特殊需要在几个不同方法间作出选择。此外，该试剂盒所能用处理的样品容量范围也很大。因此，对于检测工作量大的实验室来说，新的试剂盒将成为有用的工具。