某些不含有Rox?均一化参比染料，或是无法在整个实验过程中使用参比染料的定量PCR平台，常常试图贬低使用参比染料的价值。然而事实是，在定量PCR反应过程中Rox?染料是一种非常有价值的工具，能带来以下多方面好处：
- 校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变；
- 为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响；
- 均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；
- 均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。
美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)认识到均一化工具(Rox?参比染料)的好处，并在所有AB定量PCR仪上优化，以便实验人员充分利用Rox?参比染料所带来的好处。此外，所有AB生产的Real-TimePCR Master Mix试剂液都预掺入*合适量的Rox?参比染料，从而确保每次实验每个反应都获得*好的结果。
Rox?校正单次反应运行中的信号改变
在理想反应条件下，报告荧光染料的信号值起始于基线，当反应体系中存在合适的靶分子时，报告荧光染料会随着PCR反应的进行，产生出一条典型的扩增曲线，仪器软件通过扩增曲线计算结果。如果扩增曲线只是简单地根据报告染料的荧光信号而绘制，将会难以区分样品的真实差异和随机反应条件带来的人为差异。现实中，有许多事件可能影响报告荧光染料的表现：泡沫会形成荧光信号尖峰；蒸发或冷凝会造成反应体系浓度改变，导致不同反应批次间荧光信号值增强或减弱(见图1)。这类事件会同时影响报告荧光染料和Rox?参比染料，所以使用AB的定量试剂与仪器时，根据Rn值绘制扩增曲线，采集的是报告荧光染料减去Rox?参比染料的荧光差值，任何潜在的人为误差因素都被均一化，从而排除在*终结果之外。
图1：多组分图显示Rox?信号和报告染料信号一同抬起，结果指示存在蒸发
Rox?提供强大的故障分析工具
Rox?参比染料作为故障分析工具的价值同样不应被低估。如果一个反应失败了，依靠Rox?参比染料确保在反应过程中有持续不变的信号标准十分重要。Rox?信号可以提供反应设置的信息提示：无Rox?信号，很明确地表明没有放置MasterMix试剂；异常大的信号值强度差异，提示可能放置了2倍反应体系；Rox?信号不规则变化，提示可能存在仪器故障。AB公司的技术支持在故障排除工作中总会使用Rox?参比染料，以帮助在更短时间内获得更多信息量的检测结果。
Rox?均一化反应体积差异
以下实验数据证明了Rox?参比染料在校正移液误差所导致的反应间均方差上的价值，同时也证明AB定量PCR仪器在使用或不使用Rox?参比染料都能获得很好的性能表现和**性。
实验一：获得高**性不一定需要Rox?
从AB RNase P Instrument verification Plate中取出反应混合液，分别移液入对应的Fast 96孔板中。在AB 7500 Fast Real-Time PCR仪上运行这块板。数据分析分别采用2组模式，一组为正常的减去Rox?参比染料，另一组将参比染料设置成“None”，从而显示使用Rox?信号均一化处理数据的价值。技术重复(24次重复)的结果显示，使用Rox?和不使用Rox?都得到了很好的结果。使用Rox? 一组的Ct值SD(标准偏差)0.042，不使用Rox? 一组的Ct值SD(标准偏差)0.108(见图2)。
图2：技术重复的扩增曲线，分别采用Rox?校正(2A)和不采用Rox?校正(2B)，显示重复的结果聚合紧密，散布很小。
实验二：Rox?均一化处理校正移液错误
通过系统地减少从RNase P Plate中移出的样品，加入分子纯级水补齐体系，来模拟移液错误对运行**性的影响。图2描绘了实验一中的原体积样本，以及3个移液错误重复：分别含0.5, 1.0 和1.5μl of ddH2O(样本体积相应减少)。数据分析时使用Rox?参比染料校正初始浓度差异(由移液错误导致的)，得到的Ct值SD(标准偏差)为0.075；而不使用Rox?参比染料校正的Ct值SD(标准偏差)为0.174(见图3)。
图3：技术重复与3重模拟样本移液错误(分别用0.5, 1.0 和1.5μl ddH2O替代等量样本模板)的扩增曲线。使用Rox?可以校正起样本始体积(或浓度)的轻微差异(3A)，而不使用Rox?时可以明显看到轻微的散布(3B)。
实验三：Rox?均一化处理确保定量反应**性
相似地，直接从RNAse PPlate中移出反应混合液进行重复实验绘制标准曲线，比较使用Rox?和不使用Rox?分析时的**性差异(见图4)，结果R2值分别是0.997和 0.99。
图4：重复RNAseP标准品的扩增曲线，数据分析时分别用Rox?(4A)和不用Rox?(4B)，结果表现都很好。
当反应体系中部分样品被1μlddH2O替代，Rox?均一化处理能够校正此类小错误，而当分析不包含Rox?参比染料校正时，各个标准组中很明显地出现了更大的点散布(见图5和表1)。
表1：计算重复进行RNAseP标准曲线实验的标准偏差(SD)，将其与1μl反应混合液被ddH2O取代的实验结果比较。使用Rox?校正可有效减少错误。
图5：重复RNAseP标准品，及模拟移液错误样本(1μl反应混合液被ddH2O取代)，绘制扩增曲线。数据分析时分别使用Rox?(5A)和不用Rox?(5B)，证明Rox?可以校正由轻微起始样本浓度或反应体积错误而造成的差异。
表1显示了各个浓度重复反应的结果标准偏差(SD)。其中，直接从RNAsePplate中移出反应混合液进行的重复实验，使用Rox?或不使用Rox?所得的Ct值SD(标准偏差)差异很小(平均小于0.04)。可是当模拟移液错误时，不使用Rox?校正所得的Ct值SD差异远远大于使用Rox?校正时的结果(10倍于后者)。以上结果再次证明了使用Rox?参比染料分析Real-TimePCR实验数据时的优势。
总之，以上实验的模拟错误只是任何实验室Real-TimePCR平台在实际操作中可能遇到的诸多错误中的一个。考虑到这类错误在日常中常常会出现，再加上上文中提到的其它与定量PCR平台相关的可能人为错误，显而易见，分析Real-TimePCR数据时使用Rox?均一化具有明显的好处。