Tunel凋亡检测技术服务
一、Tunel凋亡检测的意义
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，Tunel凋亡检测适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、Tunel凋亡检测的原理
细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。所以通过TUNEL法，即DNA片段末端标记（Fragment End Labeling, FragEL）从而可进行凋亡细胞的检测。
三、Tunel凋亡检测步骤
1、脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；
2、水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）；
3、浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min；
4、固定：浸入4％多聚甲醛15 min；
5、浸洗：PBS 5 min×2次；
6、细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT；
7、浸洗：PBS洗5 min；
8、固定: 浸入4％多聚甲醛5 min；
9、、浸洗：PBS 5 min×2次；
10、平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min；
11、制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。
12、标记反应：加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。
13、终止反应：浸入2×SSC 15 min；
14、浸洗：PBS 5 min×3次；
15、封闭POD：浸入0.3％H2O2 15 min；
16、浸洗：PBS 5 min×3次；
17、酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min；
18、浸洗：PBS 5 min×3次；
19、DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。
20、用去离子水冲洗几次；
21、用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。
22、加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200～500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。
四、Tunel凋亡检测注意事项
1、结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
2.初次检测细胞凋亡，*好设置阳性对照片。
3.血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。
4、苏木素的复染时间需要摸索。
5、每片所加试剂可调整，一般30～100 ml不等，但也要防止液体挥发而干片，且反应均在放置湿盒内。
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