代做实验**组化技术服务

**组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解**的发病机理和病理。

**组化是利用抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min 。

2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min 。

3、PBS冲洗2-3次，每次5min 。

4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性 。

5、PBS冲洗2-3次，每次5min 。

6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温 。

7、PBS冲洗2-3次，每次5min 。

8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体 。

9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）。

10、PBS冲洗2-3次，每次5min 。

11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h 。

12、PBS冲洗2-3次，每次5min 。

13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h 14、PBS冲洗2-3次，每次5min。

15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞） （显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）。

16、自来水冲洗10分钟终止反应 。

17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化。

18、自来水冲洗10-15min。

19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检。

1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；
2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；

    组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备上等的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，**于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；
3、产生组织切片非特异性染色
1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是*重要的一条；
2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4、**组化染色呈阴性结果
1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；
2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是*佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；
3）组织切片本身这种抗原含量低；
5、背景
1）考虑一抗浓度高；
2）然后调整DAB孵育时间；
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