分子杂交服务
技术服务详细描述
分子杂交(molecular hybridization)是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链,以测定某特异序列是否存在。这种方法已成为遗传学和分子生物学等生命学科中*为普遍和重要的方法之一。分子杂交的方法多种多样,但其共同特点是:①都是应用复性动力学原理;②都必须有探针(probe)的存在。所谓探针就是用同位素或非同位素如荧光染料,生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列。我们常用的分子杂交方法有以下几种:
一 原位分子杂交(in situ hybridization)
原位分子杂交有两类,一类是玻片原位杂交,另一类是膜上原位杂交。前者一般都先要制片,如中期染色体片和组织切片等,片子制好后不染色,放在缓冲溶液中缓缓变性,然后再加入探针让其复性,将没有结合的探针充分洗脱,若是同位素标记探针,就须在片子上涂一层乳胶或覆盖上一张同样大小X光片进行放射自显影,然后观察同位素的爆光点在组织或染色体分裂相上的相对位置。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。近年来已发展了多色荧光技术。原位分子杂交可用来进行染色体的基因定位,或观察组织中不同的 RNA的分布。在果蝇早期的发育中,就采用了这种方法研究不同基因的表达调控。
膜上分子杂交是将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜),这种膜只吸附单连DNA。将影印好的膜用NaOH处理,这样不仅可以杀死**,同时可使DNA变性吸附在膜上,然后用无关的单链DNA,如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处,称预杂交,防止探针被吸附在背景上,干扰实验结果,膜经中和、烤干后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性,经放射自显影来确定阳性菌落。这种方法常用来从基因文库(gene bank或gene library)中来钓基因
二 斑点杂交(dot blotting)
斑点杂交也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上,或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上,后将膜变性处理,预杂交后,经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性,洗涤干燥后进行放射自显影,观察结果。(图9-29)这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或序列。来分析DNA样品之间的同源性。此法因有假阳性的存在,所以发现阳性斑后还要进一步做Southern blotting加以验证。
三. Southern 杂交
DNA 杂交是Southern,E.M于1975年首先建立的,故称为Southern杂交,该方法经 Southern 印迹法将胶上的电泳条带吸到印尼龙膜上,然后和DNA探针杂交,用这种方法可以制作染色体的物理图谱,限制性片段长度的多态性,及动物吸印(Zoo blot)(用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行Southern blotting)等。
四. Northern杂交
作者Alwine,D.J.(1977)等都不姓“Northern”,因“Southern”意为“南方”,故戏称他们的分析方法为“北方”“(northern)杂交。northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验物是RNA,而不是DNA。首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA,然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA,变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链,影响泳动率,干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上,在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。
五. Western blotting
既然有了“南方”杂交,“北方”杂交,那么随之而来的就是“西方”杂交(Western blotting),但Western blotting和前面的几种杂交都不相同,它是用来测蛋白而不是检测核酸。此法是由电场的作用将电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上,以亲和反应或**反应或结合反应测定蛋白质技术。
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