Western Blot/**沉淀
代做实验，Western Blot，实验外包
技术服务详细描述
、 蛋白质抽提
A、 组织样品，取适合量的新鲜组织样品或正确保存的组织样品（非常重要），加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂，匀浆后抽提总蛋白或核、膜蛋白。
B、 细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，用PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml-1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂抽提总蛋白或核、膜蛋白。
2、 蛋白质定量：用Bradford检测或BCA蛋白检测试剂检测蛋白的浓度。
3、 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE）
用微量加样枪准确加样到相应的加样孔中，安装电泳分离蛋白。
4、 蛋白转移到硝酸纤维膜或PVDF膜上。
按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4℃转移过夜。
5、 膜的封闭和抗体孵育
A、 膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非物异结合。
B、 封闭过的膜加入**抗体室温孵育膜1.5h,抗体抗原结合。
C、 加入HRP标记的二级抗体以结合**抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时，加入HRP标记的GAPDH/b-actin抗体可以同时检测GAPDH/b-actin含量。
6、 结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X光胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用Image分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。
7、 数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH/b-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的蛋白相对含量。
8、 提供实验报告：包括详细的实验方法及**印迹实验结果的相关图片和数据。
**沉淀(immunoprecipitation, IP): IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及**蛋白质的"prorein A"特异性地结合到**球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
1. 实验*需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
2. 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
3. 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
4. 其余操作同Western Blot。
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