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代做实验:EMSA实验技术服务
代做实验:EMSA实验技术服务
探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是*少50fmol.
蛋白样品用量: 一般用量在2---20ug(控制在1-5µl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.
poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构,可抑制蛋白对标记探针的非特异结合,避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合,比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。
未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探真来说,其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100倍. 再这里我引申的解释一下其他的对照的含义:
◆. 常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);
◆ 阴性对照反应(核蛋白+标记探针);
◆ 阳性对照(核蛋白+标记探针)
◆ 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);
◆ 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针);
◆ Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体).
4. 预电泳和电泳:0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V,电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!
5. 电转运
在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!
6.紫外交联: 正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!
条件比较成熟!可以借鉴!
7. 化学发光反应
包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!!!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.
代做实验:EMSA实验技术服务
上海拜沃生物科技有限公司提供代做实验:EMSA实验技术服务
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电话: 55890177
联系人:李波
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