医学SCI包发-实时荧光定量PCR实验注意事项
上海拜沃生物科技有限公司专业提供实验外包-实时荧光定量PCR实验服务，下面是一些荧光定量PCR实验的注意事项，希望能给各位老师提供帮助。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压**除去残留的DEPC。不能高压**的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤**。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是*有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容
在所有RNA实验中，*关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压**等。
研究人员造成的污染 RNA酶*主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。
但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
注意：DEPC有致癌之嫌
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