医学SCI包发-酵母双杂交文库构建技术

 

　　酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain, BD），C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain, AD）。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列（upstream activation sequence, UAS）结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才能具有完整的转录激活因子的功能。

 

　　酵母双杂交文库可用来研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白与蛋白间相互作用中起到关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白等。

    研究内容

转大肠杆菌：文库构建完成后进行分析鉴定，包括库容量、插入片段大小、全长率、冗余度、Blast结果等；

转酵母菌：文库构建完成后进行分析鉴定，包括库容量、插入片段大小等。

技术参数

1、样本要求

 

        （1）建库样品为组织：请提供足量的新鲜样品（4℃保存，不超过**）或将新鲜样品立即存于液氮或－80℃，保存不超过一个月；如为植物样本，为了降低文库中的叶绿体污染，样品须是黄化苗。

 

          （2）RNA 样品要求：总RNA＞50 μg，浓度＞0.3 μg/μL；OD260/280值：2.0，以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。RNA的总量根据库容量不同会有所增加。

 

2、项目执行周期

 

          （1）转大肠杆菌的全长文库运转周期约为42个工作日，均一化增加10个工作日，百万扩增加10个工作日；

 

          （2）转酵母细胞的全长文库运转周期约为45个工作日，均一化增加10个工作日。

 

3、完成指标及提交结果

 

（1）转大肠杆菌：

 

文库合格标准： 插入片段平均长度1kb，库容大于1×106克隆，空载率<10%；若为均一化C库，冗余度小于10％（以两板的文库送检结果为准）；

提交结果： 初始库容大于106转化菌液、测序文库送检报告及结题报告。

 （2）转酵母菌：

 

文库合格标准： 插入片段平均长度1kb，库容大于1×106克隆，空载率<15%；

提交结果： 初始库容大于106转化菌液及结题报告。

注：进行酵母菌转化无法通过测序进行文库鉴定，因此，无全长率和冗余度标准。

 

 

 

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