南方医科大学的Maggie与我们分享了一种构建含有复杂结构片段重组质粒的方法。
参选项目：让含有复杂结构片段重组质粒的构建成为可能
背景：*近在对一个抑癌基因进行启动子活性分析，由于这个基因的启动子序列、结构十分复杂，GC含量高、多个甲基化位点、可能还具有回文结构。从基因组中扩增获得这个基因的启动子难度很大。为此我们也尝试了众多的引物、方法。经过一段时间的努力之后，我们只能利用没有引入酶切位点的引物扩增获得了这个基因的启动子序列，但是我们利用引入酶切位点的引物尝试扩增获得此基因的启动子，结果都以失败告终。但是由于成功扩增获得的启动子没有引入酶切位点，无法连入目的载体中，只能利用TA克隆，连入T载体中。将目的片段连入T载体后，我们曾经尝试以此重构质粒作为模板进行PCR扩增，以在目的片段的两端引入酶切位点，将其连入目的载体中，但是由于其复杂的结构，GC含量高、高甲基化等等，尝试采用很多引物都不能将其从重组质粒中扩增出来，本来这种从质粒中扩增获得目的片段是一件很容易的事情。
我们只能采取酶切的方法将其从T载体中卸下来。这时我们又碰到了一个**的难题，由于目的片段和载体的大小十分接近，目的片段大小为2.6kp，载体的大小为2.7kp，在进行割胶回收的时候很难将其分开。PCR和割胶回收都很难将其分开。所以我们就只能在割胶时将T载体的片段和目的片段都切割下来，胶回收获得的是两条片段，若直接这样与目的载体进行连接，通过克隆转化出来的重组质粒就存在着两种可能一个是将T载体的片段连入了目的载体中，另一种可能才是将目的片段连入了克隆载体中，并且获得它们克隆的概率各是50%。若直接采取这种方法的话，*后挑取的克隆只有将近一半是正确的克隆（或者更少），不走运的话，可能挑取的克隆都没有正确的。这样即浪费了试剂又浪费了时间。
方法改进：针对这种情况，我们在割胶回收到T载体的片段和目的片段后，采用限制性内切酶EcoRI进行酶切，由于T载体中含有此酶切位点，而我们的目的片段中不含这个酶切位点，所以就可以将T载体的片段打断，我们此时再进行割胶回收，获得的就只是目的片段了。然后再将其与目的载体进行连接。
结果：成功构建了含有目的片段的重组质粒。