一直以来，研究人员都很有兴趣了解细胞在各种不同状态下的基因表达差异，并开发出多种方法，来不断提高灵敏度和增加通量。基因表达芯片是近年来较多采用的方法，但它如今却碰上了一个强劲对手——RNA-Seq。
RNA-Seq可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。除了分析基因表达水平，RNA-Seq还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达。
RNA-Seq的动态范围更广，且假阳性可能更小，这意味着RNA-Seq的数据重复性应当比芯片要高。RNA-Seq能够检测样品中的所有RNA，这对于鉴定细胞的新颖转录本来说是个优点，但同时缺点在于，它检测了总的RNA，而细胞中很大一部分RNA都来自核糖体和线粒体。这限制了其他RNA的读取数量以及这些RNA表达水平的准确性。因此，polyARNA选择和核糖体RNA去除等方法被开发出来，以便解决这个问题。
然而，这些分离方法有可能会引入潜在误差，影响实验结果。因此，第三代测序公司HelicosBioSciences的研究人员对操作方法修改后可能发生哪些差异进行了研究，文章发表在*近一期的《PloS ONE》上。
他们认为，对于研究人员来说，必须了解以下几点：技术差异如何影响结果的质量和可解释性，操作方法如何引入潜在误差，RNA的来源如何影响转录检测，以及所有这些差异如何影响得到的结论。
HelicosBioSciences公司的研究人员使用了多个人RNA样品，来评估RNA片段化、RNA分离、cDNA合成，单个以及多个标签计算。尽管采用polyARNA选择的操作方法得到了*多的非核糖体读取，并能够***测定编码转录本，但研究人员发现这种方法只能检测人细胞中的一部分非核糖体RNA。
polyARNA排除了数千个注释的转录本以及更多未注释的转录本，使得转录组查看不完全。而核糖体去除的RNA则提供了一个更经济的方法，来生成完整的转录组覆盖。与多个标签相比，利用单个标签的表达测定具有评估基因表达和检测短RNA的优势。
这项工作有望帮助研究人员在分析基因表达时选择适当的产品.
原文检索：Raz T, Kapranov P, Lipson D, Letovsky S, Milos PM, et al. (2011)Protocol Dependence of Sequencing-Based Gene ExpressionMeasurements. PLoS ONE 6(5): e19287.doi:10.1371/journal.pone.0019287
摘要：RNA Seq provides unparalleled levels of information about thetranscriptome including precise expression levels over a widedynamic range. It is essential to understand how technicalvariation impacts the quality and interpretability of results, howpotential errors could be introduced by the protocol, how thesource of RNA affects transcript detection, and how all of thesevariations can impact the conclusions drawn. Multiple human RNAsamples were used to assess RNA fragmentation, RNA fractionation,cDNA synthesis, and single versus multiple tag counting. Thoughprotocols employing polyA RNA selection generate the highest numberof non-ribosomal reads and the most precise measurements for codingtranscripts, such protocols were found to detect only a fraction ofthe non-ribosomal RNA in human cells. PolyA RNA excludes thousandsof annotated and even more unannotated transcripts, resulting in anincomplete view of the transcriptome. Ribosomal-depleted RNAprovides a more cost-effective method for generating completetranscriptome coverage. Expression measurements using single tagcounting provided advantages for assessing gene expression and fordetecting short RNAs relative to multi-read protocols. Detection ofshort RNAs was also hampered by RNA fragmentation. Thus, this workwill help researchers choose from among a range of options whenanalyzing gene expression, each with its own advantages anddisadvantages.