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**组化染色结果显示
 2.6 半定量分析
　  样本由Switchos泵以60 μL/min的流速经阀1加载到柱1。Switchos泵同时也是将盐溶液加载到柱1上的上样泵。**维分析用系列盐溶液(0，50，100，200，400，800，1000，2000和2000 mmol/L NH4Ac)依次洗脱样本，洗脱的样本经阀2进入柱2脱去无机盐类。通过阀2的切换开始**维分析; **维反相分析使用的流动相为A相：95%水、5%乙腈、0.1%甲酸;B相：5%水、95%乙腈、0.1%甲酸。梯度为：0～90 min, 5%～50% B; 90～95 min, 含95% B的流动相再生柱3; 95～110 min, 含5% B的流动相平衡柱3。由Ultimate泵以2 μL/min的流速按照梯度在柱3上得到分离后实时送入LTQ?Orbitrap质谱仪。设置LTQ?Orbitrap质谱仪扫描质量范围为400～2000 Da(分辨率60000)，将扫描获得的谱图中*强的5个质谱峰进行串级质谱(MS/MS)分析。
　　尿素、碳酸氢铵、甲酸 ;Bradford定量试剂盒 ;二硫苏糖醇、3?[(3?胆固醇氨丙基)二甲基氨基]?1?丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、乙腈和胰蛋白酶 ;碘乙酰胺、醋酸铵 。超纯水由Milli?Q纯水系统 制备。
　　分析过程**使用3根色谱柱：**维分析使用强阳离子交换Bio?SCX柱(柱1，内径1 mm，柱长150 mm，荷兰LC?Packing公司);**维反相分析前使用脱盐/肽段富集柱Captrap柱(柱2，内径0.5 mm，柱长2 mm， ;**维反相分析使用Zorbax?C18柱(柱3，内径0.3 mm，柱长150 mm， 。
　　对前3种蛋白进行了**组化分析。**组化染色结果显示,Vimentin，14?3?3 epsilon蛋白和CA Ⅱ在HB组织中的基质细胞及内皮细胞均呈阳性表达，而在正常人脑组织中呈阴性表达。
　　具体方法为：(1)选取/提取合适量的两组样本;(2)选择内标，该内标要求在两组样本中皆稳定存在，异构体少并且在样本中的含量不发生变化或变化极少。本实验选用Beta肌动蛋白作内标;(3)样本酶解后的肽段采用色谱?质谱联用仪鉴定;(4)计算每个得到鉴定的蛋白质的肽段的色谱峰面积， 利用内标对蛋白质的色谱峰面积进行归一化;(5)比较两组样本中得到鉴定的蛋白质的归一化后的色谱峰面积作为比较定量的结果;(6)选择1.5倍作为明显差异的阈值,。
 半定量分析
　　**神经系统血管母细胞瘤(Central nervous system hemangioblastoma，HB)是常见于小脑的良性肿瘤，其发病机理至今尚未阐明。世界卫生组织在 ( Hippel?Lindau氏病，简称VHL病[7])，并未从蛋白质组角度对其进行过研究。因此，采用蛋白质组学分析技术研究HB，对探讨其致病机理有着重要意义。
　　取HB组织和正常脑组织标本同时进行层厚4 μm的常规石蜡切片，使用SABC试剂盒进行**组化染色，显微镜下观察，以细胞核和(或)细胞质出现棕黄色染色为阳性。阴性对照以磷酸盐缓冲溶代替一抗，阳性对照参考各产品说明书。
　　在进样的蛋白质总量相同的条件下，以得到的每一个蛋白质的所有得到鉴定的肽段的色谱峰积分面积之和作为蛋白质自身的“峰强度”In，计算出每一个蛋白质在样本中的相对丰度(In%，即蛋白质的峰强度占样本所有峰强度和的百分比)，然后以细胞骨架蛋白Beta肌动蛋白为内标，将样本中Beta肌动蛋白百分比进行归一化校正，以其它蛋白质在两组样本的百分比的比值作为半定量的依据。
　　2.7 **组化
　　HB细胞和神经元细胞(各约106个)分别与1 mL细胞裂解液(8 mol/L尿素、4% CHAPS、1 mmol/L PMSF、1 mg/L 亮抑酶肽、1 mg/L胃蛋白酶抑制剂)混合，冰浴中孵育30 min，15000 g×15 min离心(4 ℃)，取上清液1。沉淀加入细胞裂解液100 μL进行超声破碎，15000 g×15 min离心(4 ℃)，取上清液2。合并上清液1和2， 25000 g×30 min离心(4 ℃)，取上清液，-80 ℃保存。蛋白质浓度使用Bradford定量试剂盒测定。
　　2 实验部分
　　蛋白质表达量变化信息是蛋白质组研究的重要内容之一。与稳定同位素标记定量法[1]相比，无标记的蛋白质半定量方法是一种为了弥补单纯依靠质谱信号强度定量的不足而提出的定量方法。本方法结合了传统色谱法的以色谱峰面积为基础的定量方法，以肽段鉴定为基础进行色谱峰的选取。其优点在于：具有较好的重现性和线性范围;无需额外操作(如同位素标记)，定量步骤全部由计算机完成;可以灵活选择加入已知量的已知蛋白质或以样本本身含有的蛋白质为内标[2～6]。


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